实验六__过氧化氢酶米氏常数(Km)的ppt课件

实验七过氧化氢酶米氏常数（Km）的测定,1,一、实验目的,学习米氏常数（Km）的测定方法。,2,二、实验原理,过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：2H2O22H2O+O2H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。2KMnO45H2O23H2SO42MnSO4K2SO45O28H2O求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。,3,米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）,1Km11=.+vVmaxSVmax,4,三、试剂,10.05mol/L草酸钠标准液将草酸钠（AR）于100105烘12h。冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO45ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。2约0.02mlKMnO4储存液称取KMnO43.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。,5,30.004mol/LKMnO4应用液取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4ml，于70水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。4约0.05mol/LH2O2液取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/LKMnO4标定之，稀释至所需浓度。50.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。,6,四、操作步骤,l血液稀释吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至150ml，得1：1500稀释血液。2H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.05mol/L的H2O22.0ml和25%H2SO42.0ml，分别用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。,7,3反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。,8,9,依次加入1：1500稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，反应时间5min，按顺序向各瓶加25%H2SO42.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。最后用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶至微红色，记录KMnO4消耗量(ml)。,10,五、计算,1.反应速度的计算：以反应消耗的H2O2mmol数表示。反应速度=加入的H2O2mmol数剩余的H2O2mmol数即：H2O2mol浓度加入的毫升数KMnO40.004mol/L消耗的KMnO4毫升数5/2（式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数）,11,2求Km值：下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.05mol/L，列表计算如下：,12,按前述方法