密度梯度离心法取单个核细胞具体方法ppt课件

密度梯度离心法取单个核细胞,1,密度梯度离心法,密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。,2,密度梯度离心法,3,密度梯度离心原理,不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。,4,密度梯度离心可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。,5,密度梯度离心法,也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。,6,蔗糖密度梯度离心法,采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。,7,分离活细胞的介质要求,1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。,8,密度梯度离心法应用,利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞（PBMC）。目前比较常用ficoll密度梯度法。,9,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）的实验方法,一、步骤1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。2.取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm20分钟。3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。,10,11,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入倍以上体积的Hanks液或RPMI1640，1500rpm10分钟，洗涤细胞两次。5.末次离心后，弃上清，加入含有10小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。,12,单个核细胞浓度(细胞数1毫升细胞悬液)1042（稀释倍数）,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,13,6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞百分率100用本法分离PBMC，纯度在90以上，收获率可达8090，活细胞百分率在95以上。,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,14,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,二、试剂和材料比重1.0770.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。Hanks液(无Ca、Mg)10小牛血清RPMI16400.2台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。肝素用Hanks液或生理盐水稀释成500单位ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位1毫升血。短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。无菌干燥注射器针头。血球计数板、显微镜、水平式离心机。碘酒，75酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。,15,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,三、注意事项抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。,16,实验所需试剂的配置方法,一、Hanks液(无Ca、Mg)配制法NaCl：8.0克KCl：0.4克NaHPO12HO：0.12克KHHPO：0.06克葡萄糖1.0克双蒸水1000毫克1酚红液2毫克将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4冰箱保存，临用时调PH至7.37.6。,17,实验所需试剂的配置方法,二、细胞分层液配制法9聚蔗糖24份34泛影葡胺10混合，测比重为1.0771.078，G玻璃滤器过滤除菌。冰箱保存备用。,18,实验所需试剂的配置方法,三、磷酸缓冲液(PB)原液:A液:0.2MNaHPO溶液NaHPO27.6克或NaHPO2HO31.2克蒸馏水溶解至1000毫升B液：0.2MHaHPO溶液HaHPO12HO71.6克蒸馏水溶解至1000毫升各种不同PH值PB的配法,19,实验所需试剂的配置方法,举例：0.1MPH7.2PBA液28mlB液72ml加蒸馏水100ml,20,实验所需试剂的配置方法,四、血球保存液葡萄糖2.05克枸椽酸钠0.8克氯化钠0.42克蒸馏水100毫升将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4保存备用。,21,实验所需试剂的配置方法,五、RPMI-1640培养液RPMT-1640(FLOW公司出品)1袋三蒸水1000毫升电磁搅拌30分钟：1NHCl调PH7.27.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4保存。,22,实验所需试剂的配置方法,六、不完全RPMI-1640培养液RPMI-164095毫0.1M丙酮酸钠1毫0.2M谷氨酰胺1毫升1MHepes1毫升7.5NaHCO1毫升青霉素、链霉素(各1万单位)1毫升,23,实验所需试剂的配置方法,七、完全RPMI-1640培养液不完全1640培养液90毫升灭活胎牛(或新生牛)血清10毫升,24,实验补充知识,聚蔗糖泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。,25,实验补充知识,分离人外周淋巴细胞以密度为1.0770.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.0761.090之间。而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时