生物化学-RNA的生物合成和加工.ppt

第36章,RNA的生物合成和加工（转录）RNABiosynthesis,Transcription,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录,经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和hnRNA,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA-pol)其他蛋白质因子,主要内容,第一节模板和酶第二节转录过程第三节转录后加工第四节RNA复制和逆转录,模板和酶,第一节,一、转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作负链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为正链。,5GCAGTACATGTC3,3cgtgatgtacag5,5GCAGUACAUGUC3,NAlaValHisValC,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录,在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。,模板链（含结构基因）,编码链,二、RNA聚合酶,（一）原核生物的RNA聚合酶,核心酶,全酶,此外，每个RNA聚合酶还含有2个Zn离子。,亚基由基因rpoZ编码，Mr为1.10104，曾长期被忽略，甚至许多人不把它作为聚合酶的组分。然而，现在已经肯定，亚基是嗜热水生菌RNApol必不可少的组分，也是体外变性的RNApol成功复性所必需的，它与亚基一起构成催化中心，稳定其与亚基的结合。,E.coli不同因子的性质与功能比较,（二）真核生物的RNA聚合酶(458),三、启动子和转录因子,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游的调控序列。,RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，称为启动子(promoter)。,LOREMIPSUMDOLOR,RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子（蛋白质）称为转录因子(transcriptionalfactor)。,RNA聚合酶保护法,开始转录,TTGACAAACTGT,-35区,(Pribnowbox),TATAATPuATATTAPy,-10区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognitionsite),RNA聚合酶全酶结合位点,转录过程,第二节,大肠杆菌RNA聚合酶的作用,起始阶段：在DNA分子上搜索启动子，并将DNA双螺旋解开一小段。,延伸阶段：选择正确的核苷三磷酸（NTP），催化磷酸二酯键的形成。,终止阶段：检测RNA合成的终止信号，停止RNA的合成。,特点：不需引物；无核酸外切酶活性。错误率高：1/104105核苷酸,是DNA复制的105倍。,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物的转录过程,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2.DNA双链解开，约解开17个碱基对。（酶与启动子结合的部位是AT富集区，有利于解链）,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi,转录起始过程,3.第一个核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)结合到全酶上，形成“启动子-全酶-核苷三磷酸”三元起始复合物。,4.第二个核苷酸参入，连结到第一个核苷酸的3羟基上，形成了第一个磷酸二酯键。,因子从全酶上掉下，又去结合其它的核心酶。,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3,转录起始复合物:,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断沿53方向延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,DNA上的解螺旋区：在RNA链延伸的同时，RNA聚合酶继续解开它前方的DNA双螺旋，暴露出新的模板链，而后面被解开的两条DNA单链又重新形成双螺旋，DNA上的解螺旋区保持约17个碱基对的长度。,转录空泡(transcriptionbubble)：,RNA-pol（核心酶）DNARNA,RNA链的延伸图解,3,5,RNA-DNA杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生RNA,复链,解链,RNA-DNA杂交区：刚合成出来的RNA链与解开的DNA模板链之间可形成一小段RNA-DNA杂交区。随着核心酶的移动，RNA链不断地延伸，杂交区也往前延伸，但后面的杂交区随着DNA双螺旋的恢复，RNA链逐渐被置换出来，因此，杂交区也保持着固定一小段。,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,依赖Rho()因子的转录终止不依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,ATP,1.依赖Rho因子的转录终止,因子是基因编码的蛋白质，是一种酶，在水解ATP的情况下，它沿着53方向转录物的3端前进，直到遇到暂停在终止点位置的RNA聚合酶。随后因子通过解链酶的活性解开转录泡（transcriptionbubble）上的RNA/DNA形成的杂交双螺旋，使RNA转录物得到释放，从而终止转录。,依赖因子（rhofactor）的终止子,2.不依赖Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,这类终止子结构上有2个特征,（2）发夹结构末端紧跟6个连续的U，这发夹结构阻碍了聚合酶的进一步延伸，RNA链的合成就终止，酶和mRNA就从模板DNA上释放。,（1）DNA链的3端附近有回文结构，富含G-C碱基，随后紧跟的是A-T碱基，转录而形成的RNA具有茎环的发夹形结构。,不依赖于因子的终止,AT富集区,GC富集区,不依赖因子的终止子结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promoter),终止子(terminator),二、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,1.转录起始前的上游区段,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-actingelement),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2.转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，或具有识别RNA聚合酶的作用，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。又称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。,3.转录起始前复合物(PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子帮助间接结合到DNA分子上。,TFF,A,B,由RNA-Pol催化转录的起始前复合物,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,起始前复合物组装完成，TFH使CTD磷酸化,RNA-Pol羧基端结构域,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAAGTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA3mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关。,DNA复制与转录的比较,相同点,模板两股DNA单链均作为模板为模板链原料dNTPNTP合成方式半保留复制不对称转录聚合酶种类DNA聚合酶RNA聚合酶RNA引物需要不需要产物半保留的双链DNA单链RNA,不同点,需要DNA为模板需要核苷三磷酸为原料遵循碱基配对原则新链合成方向均为53,1.嘌呤和嘧啶类似物核酸代谢的拮抗物：抑制核酸合成有关的酶掺入核酸分子形成异常核酸如：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6二氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶进入体内变成相应的核苷酸表现抑制作用,三、RNA生物合成的抑制剂P469,2.DNA模板功能的抑制物（1）烷化剂（2）放线菌素D（actinomycinD）与DNA形成非共价复合物其作用如同阻遏蛋白抑制DNA转录和复制。色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素（3）嵌入染料使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸，导致移码突变，并能抑制RNA链的起始。,利福平,抑制细菌RNA聚合酶活性,某些常用的转录抑制剂抑制剂靶酶抑制作用利福霉素细菌的全酶与亚基结合阻止起始利链霉素细菌的核心酶与亚基结合阻止延长放线菌素D真核DNA与DNA结合并阻止延长-鹅膏蕈碱真核RNAPol与RNA聚合酶结合,转录后加工,第三节,几种主要的修饰方式,1.拼接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),tRNA和rRNA被加工的证据,rRNA和tRNA有以下三点特性：1）所有RNA初级转录产物的5末端均是5-三磷酸，而成熟rRNA和tRNA分子的5末端是5单磷酸；2）rRNA和tRNA分子比初级转录产物小很多；3）所有tRNA含有稀有碱基。,（一）rRNA的加工,原核生物rRNA转录初始物:rRNA基因和tRNA基因组成混合操纵子：16SrDNA23SrDNA5SrDNAtDNA加工RNA酶对转录初始物切割再加工成熟,原核生物的转录后加工,原核生物有7个rRNA转录单位,RNase,RNase,RNaseE,甲基化碱基甲基化核糖,(二)tRNA的加工大肠杆菌染色体有tRNA基因约60个,原核生物tRNA转录初始物:tRNA基因:型-tRNA有3-CCA-OH型-tRNA无3-CCA-OHtRNA转录初始物:与rRNA相连几个相同(不同)tRNA连在一起,多顺反子转录单位,加工,RNA酶RNA酶FRNA酶DRNA酶PtRNA核苷转移酶,切开rDNA、tDNA转录产物间隔序列从3端切断前体分子核酸外切酶,切除型tRNA3-CCA-OH下游序列（核酸+蛋白）（M1RNA）内切酶，tRNA5端成熟酶催化型tRNA形成稳定的3-CCA-OH,“斩头”，去尾，剪接，3-末端添加，化学修饰,原核生物tRNA前体分子的加工,b、末端添加：3-端添加CCA序列。,c、修饰：形成稀有碱基如DH2。,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseD,RNAaseD,ACC,表示核酸内切酶的作用,表示核苷酸转移酶的作用,表示核酸外切酶的作用,表示异构化酶的作用,（三）mRNA的加工原核细胞的mRNA通常没有转录后的加工过程。,真核生物的转录后加工,4种rRNA，是两个转录单位。18S、5.8S和28SrRNA的前体是45S（一个转录单位）。5SrRNA是单独的一个转录单位。核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所。,一、rRNA的转录后加工,大多数真核细胞为成熟的28S18S5.8SrRNA的共同前体,rRNA,由核酶催化进行自身剪接,32S,多数真核生物的rRNA基因不存在内含子，有些含有内含子但并不转录，如果蝇。四膜虫可以自动切去内含子,tRNA前体,二、tRNA的转录后加工,RNA聚合酶催化合成,RNAaseP、内切酶,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,约有10%需要酶促修饰,三、真核生物mRNA的转录后加工,核内的初级mRNA称为核不均一RNA(hnRNA),定义：mRNA的原初转录物是相对分子量极大的前提，在核内加工过程中形成大小不等的中间体，即hnRNA,特点：平均分子长度为8-10Kb左右。比mRNA的平均长度(1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。,LOREMIPSUMDOLOR,hnRNA是mRNA的前体，证据是：(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；(3)两者5端都有帽子结构，表明二者为相同的聚合酶所合成；(4)两者的3端都有多聚腺苷有尾巴。,（一）首、尾的修饰,5端形成帽子结构(m7GpppGp)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail),加工过程包括：首、尾、剪接、甲基化,帽子结构,(m7GpppGp),5pppGp,帽子结构的生成,以5-5三磷酸相连,作用:稳定mRNA5端和翻译的起始有关,步骤1,步骤2,作用位置,加尾:3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail),作用：稳定mRNA，mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式,四、RNA生物功能的多样性（核酶）,具有酶促活性的RNA称为核酶。,核酶(ribozyme),Cech和Altman获得了1989年度的诺贝尔化学奖,四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,最简单的核酶二级结构锤头状结构(hammerheadstructure),底物部分,通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份组成锤头结构,除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。,第四节RNA复制和逆转录(P491),RNA的复制是指病毒基因组RNA的复制(真核生物RNA的复制只是极个别的现象),概念:由RNA复制酶(RNAreplicase)催化,以病毒RNA为模板的RNA合成。,RNA病毒在宿主细胞内繁殖时,即进行RNA复制。,一、RNA的复制,以四种NTP为底物；专一性地选择病毒RNA为模板；按53的方向合成病毒RNA；无外切酶活性（即无校对功能）。,RNA复制酶的催化性质,病毒RNA的复制方式:,1、病毒含正链RNA：进入宿主细