代谢物酶法分析技术.ppt

第五章代谢物酶法分析技术,全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）,2,代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。,酶法分析（enzymaticmethod）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。,代谢物酶法分析技术的概念,3,4,平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%5%）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法(end-pointmethod)。,平衡法的特点是测定底物的总变化量，即测定的是“浓度”。,5,速率法(rateassay)又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时(Km2，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。,但在以NADH或NADPH为底物的终点法测定中，因340nm吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。,12,在340nm处测定吸光度的增加来进行定量的方法,乳酸测定,双底物反应直接测定法,乳酸+NAD+,丙酮酸+NADH+H+,丙酮酸测定,在340nm处测定吸光度的下降来进行定量的方法,乳酸+NAD+,丙酮酸+NADH+H+,13,酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。,最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。,14,脱氢酶指示系统,氧化型辅酶NAD(P)+在340nm处没有吸收峰,还原型辅酶NAD(P)H在340nm处有吸收峰.,15,脱氢酶指示系统,以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶(NAD+)或氧化型辅酶(NADP+)变为还原型NAD(P)H后在340nm处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测定340nm处吸光度的下降来计算被测物的浓度。,16,脱氢酶指示系统,血清葡萄糖己糖激酶法测定,Glu+ATP,G-6-P+ADP,G-6-P+NADP+,P-6-GA+NADPH+H+,指示酶反应将NADP+转化为NADPH+H+，测定340nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比,17,脱氢酶指示系统,血清尿素测定,尿素+H2O,2NH3+CO2,NH3+-酮戊二酸+NADH+H+,谷氨酸+H2O+NAD+,测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定,18,常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。,体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示系统。,脱氢酶指示系统,19,过氧化物酶指示系统,共用的指示反应最早由Trinder氏等人提出，被称为Trinder反应,最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定,20,过氧化物酶指示系统,血清总胆固醇氧化酶测定法,胆固醇酯+H2O,胆固醇+O2,胆固醇+脂肪酸,4-胆甾烯酮+H2O2,红色醌类化合物,H2O2+4-AAP+酚,指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500nm处比色测定,21,过氧化物酶指示系统,常用的Trinder反应生色基团,表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶血等色素干扰。,22,利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。,酶循环法(enzymaticcyclingassay)的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶(Ea和Eb)的量。该法测定中所选择酶的Km值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。,23,使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。,检测指示系统：循环前、后用速率法测定NADH(340nm)的变化。检测产物H2O2可通过Trinder反应比色测定。,产物循环氧化酶脱氢酶系统,24,产物循环氧化酶脱氢酶系统,甘油浓度测定,通过GPO和G-3PDH使G-3P与DHAP之间循环，在反复循环中G-3P和DHAP的量不变，而产物H2O2随每次循环不断递增，同时NADH递减。在规定时间t内，H2O2累计的量决定于t和每min循环次数。,25,底物循环脱氢酶辅酶系统,用一种脱氢酶和两种辅酶(thio-NAD+和NADH)。用395nm415nm波长测定反应中氧化型thio-NAD+转为还原型thio-NADH的增加速度。,循环反应条件：酶对thio-NAD+和NADH应有高度亲和力。溶液pH和缓冲体系同时有利于双向反应。thio-NAD+和NADH二者的浓度和配比达最适条件。,26,底物循环脱氢酶辅酶系统,血淸胆汁酸测定,胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。,27,氨循环合成酶脱氢酶系统,NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成NADH，在340nm测定。,28,酶循环法具有的特点,灵敏度随反应时间的延长而提高灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高利用酶对底物的特异性,使测定系统简化利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定,29,酶活性恢复法,很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。,30,异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子,酶活性恢复法,异柠檬酸+NADP+,-酮成二酸+CO2+NADPH+H+,用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA)抑制钙离子，标本中Mg2+通过恢复ICD活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸光度的増加。,31,酶活性恢复法应用举例,丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子-半乳糖苷酶法测定钠离子淀粉酶法测定氯离子超氧化物歧化酶法测定铜离子碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等,32,激活和抑制法,有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37水浴10min，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。,有机磷的酶法测定,根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。,另有抑制ALP法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。,返回章目录,33,试剂酶质量,试剂酶概念,试剂酶特征,试剂酶纯度,酶法设计要求,酶法设计共性要求,平衡法设计的要求,速率法设计的要求,试剂酶来源,34,试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。,试剂酶的概念,35,主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。,不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。,试剂酶的来源和理化特征,36,不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。,纯度主要指标酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。杂酶含量，容易引起副反应的一些酶含量按“允许限度”的要求（见表5-2）。,试剂酶的纯度要求,37,表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求,38,39,40,所用试剂酶的特异性：怎样消除干扰因素：试剂中的附加剂：如何提高灵敏度：用PMS或黄递酶，将NADH上的氢交给四氮唑盐，在可见光监测；用酶循环法；测定荧光法。,酶法设计的共性要求,41,酶的用量要足够大，能使反应1min3min达到平衡，以保证较快完成测定。反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH等方法,并设标准管一起到达平衡以后测定。Km在保证测定线性的前提下要尽量小。,平衡法设计的要求,42,所用酶的Km应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。Km太小，可加入竞争性抑制剂加大Km。酶用量要合适，用少了