整个基因克隆实验流程(完整)

一、 组织总RNA的提取相关试剂：Trizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200l、100l/50l）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200l/300l），一次性手套，实验手套。实验步骤1. 取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。2. 转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3. 按1ml Trizol加入200l氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4. 4，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5. 小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6. 室温放置10min；4，,12000g 离心10min；7. 弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4，,12000g 离心5min；8. 弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9. 弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10. 沉淀中加入30l RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。u RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5l 或2l 规格，10l规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.92.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。（2）RNA完整性的检测：取2lRNA，与2l溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。二、 逆转录（RNA逆转录成cDNA）相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5l 或2l 规格，10l规格），100l冰盒，制冰机，PCR管）根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下：试剂使用量（l）Rnase Free H2O11.75-YOligo（dT）1Total RNA（1000ng）YTotal Volume12.7565，5min后，立即置于冰上。试剂使用量（l）上一步变性后RNA溶液12.755RT Buffer4dNTP Mixture（各10mM）2Rnase Inhibitor（10U/l）0.25Rever Tra Ace1Total Volume20然后放置于PCR仪上，反应程序为： 42,60min；99,5min；16,5min。所得cDNA放置于-20保存。三、 PCR反应相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5l 或2l 规格，10l规格），100l电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）试剂使用量（l）ddH2O6.0反转录产物1.010PCR Buffer1.0dNTP（10mmol/l）0.2Taq酶（1U/l）0.4Ghrelin-F（10mol/l）0.4Ghrelin-R（10mol/l）0.4MgCl2（25mmol/l）0.6Total Volume10反应条件：95,预变性3min；94变性30s，55退火30s，72延伸45s，共35个循环；72延伸10min。反应结束后，取5l PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。四、 PCR产物的分离，回收和纯化相关试剂：胶回收试剂盒相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200l，1ml规格），离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架）PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。将所得DNA贮存于-20。五、 目的片段与载体的连接相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10l，2.5l规格）涡旋混匀仪，制冰机）按照连接试剂盒(TAKARA公司)说明书进行操作。pMD-18T载体 1lDNA2lddH2O2l然后加入5l Ligation Mix，4/16放置 过夜连接。六、 转化相关仪器：（超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器（1000l，100l，10l，2.5l规格）涡旋混匀仪，制冰机）u CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞全过程冰上进行，4离心，无菌操作。（1）以接种环从-80保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h；（2）挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37剧烈震荡培养6h；（3）按1:100接种菌液于25ml LB液体培养基中，37震荡培养1.52h，至OD600达0.40.6；（这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低）（4）冰上预冷10min；然后4，6000rpm离心10min；（6）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20min；（7）4，6000rpm离心10min，弃尽上清；（8）以1.25ml（菌液体积的5%）预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml预冷的100%甘油（甘油终浓度达1520%），混匀后按每支100l在冰上分装。-80保存备用。u 连接产物转化到感受态细胞（1）将10l连接产物加入100l感受态菌液中，冰上放置30min；（2）然后放到42水浴锅中热激90s，再在冰上放置3min；（3）加入890l LB液体培养基，37震荡培养60min；（4）每个培养平板中加入40lX-gal和4lIPTG，然后吸取100l菌液，均匀涂布于含Amp的LB固体培养基平板上；（5）37培养箱中正放1h，待菌液被琼脂完全吸干后，倒置平板，过夜培养16h。（培养时间不宜过长，否则有卫星菌落产生）七、 菌液PCR检测相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，涡旋混匀仪，移液器（10规格，1000l规格），100l电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）在平板上挑取1020个白色菌落，加入含有1ml Amp+LB液体培养基的1.5ml离心管中，37震荡培养6h。3000rpm离心3min后吸掉上层400l上清液，短暂涡旋将沉淀打散，然后把菌液当成模板，按上面PCR方法进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带。挑选扩增出正确目的条带的菌液送公司测序。附注：主要溶液和培养基的配制1）电泳缓冲液10TBE：108g Tris碱，55g 硼酸，20ml 0.5M的EDTA，加入蒸馏水混匀后定容至1000ml，调节pH为8.0；2）LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；加800ml去离子水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000ml，高压（1.034100000Pa）灭菌20min，4保存；3）LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min后降温至5060，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于4保存；4）氨苄青霉素贮存液：用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20保存。使用时终浓度为100ug/ml。5）用于制备感受态细胞的CaCl2（0.1mol/l）：称取0.56g CaCl2（无水，分析纯），溶解于50ml双蒸水中，定容至100ml，高压灭菌；6）X-gal（20mg/ml）的配制：将20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20避光保存；7）IPTG（200mg/ml）的配制：将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22m滤膜除菌，-20保存备用；3RACE（dT）17-接头引物：5GACTC GAGTC GACAT CGA(T) 17 3接头引物：5GACTC GAGTC GACAT CG 31. cDNA的合成DEPC水9.75lOligo dT 接头引物1lTotal RNA2l (1000ng)65,5min；立即置于冰上。第一步变性后的RNA溶液12.75l5RT Buffer4ldNTP Mixture（各10mM）2lRnase Inhibitor（40U/l）0.25lRever Tra Ace1l总体积20l反应条件：42,60min；99,5min；16,5min。2. cDNA的纯化利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。最后使用20l TE洗脱沉淀。3. 第一轮PCRcDNA1l10Buffer1ldNTP（10mmol/L）0.2lOligo dT 接头引物(10mol/L)0.4l3RACE外引物(10mol/L)0.4lTaq酶(1U/l)0.4lMgCl2（25mmol/L）0.6lddH2O6.0l反应条件：降落PCR。 PCR产物稀释10倍作为模板进行下游实验。4. 第二轮PCRcDNA1l10Buffer1ldNTP（10mmol/L）0.2l接头引物(10mol/L)0.4l3RACE内引物(10mol/L)0.4lTaq酶(1U/l)0.4lMgCl2（25mmol/L）0.6lddH2O6.0l反应条件：降落PCR。5RACE1. cDNA的合成DEPC水9.75l基因特异性反义引物1lTotal RNA2l (1000ng)65,5min；立即置于冰上。第一步变性后的RNA溶液12.75l5RT Buffer4ldNTP Mixture（各10mM）2lRnase Inhibitor（40U/l）0.25lRever Tra Ace1l总体积20l反应条件：42,60min；99,5min；16,5min。2. cDNA的纯化利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。最后使用20l TE洗脱沉淀。3. cDNA的加尾纯化后的cDNA5.7l5末端转移酶缓冲液2l1mmol/l dATP2l末端转移酶（30U/l）0.3l总体积10l反应条件：37,60min；70，10min。 反应结束，把cDNA稀释1倍作模板进行下游实验。4. 第一轮PCRcDNA1l10Buffer1ldNTP（10mmol/L）0.2lOligo dT 接头引物(10mo