2.2 基因工程的载体和工具酶

第二节基因工程的载体和工具酶,基因工程的工具酶,基因工程的载体,一基因工程的载体,载体的功能及特征质粒（plasmid）噬菌体DNA,1、载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点（多克隆位点）,具有合适的筛选标记,2、质粒,质粒：是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，1kb-200kb。,质粒的基本特征,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系，根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒1-3拷贝,松弛型复制控制的质粒10-60拷贝,质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。,ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容,以大肠杆菌的质粒为例：,质粒的可转移性,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,携带特殊的遗传标记,重要的大肠杆菌质粒载体(Boyer),pBR322：,松弛型复制氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆,Ori,pUC18/19：,拷贝数2000-3000/cell装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ用于基因克隆,pUC18/19：正选择标记lacZ的显色原理,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,pUC18/19,X-gal,b-半乳糖苷酶的a-肽段,lacZ,MCS,Plac,根据蓝白斑选择转化子,质粒DNA的分离纯化,碱裂解法,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,沸水浴法,proteins,L-DNA,cccDNA,RNAs,ocDNA,cccDNA,L-DNA,1、用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体，加溶菌酶裂解细菌细胞壁；2、加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物；3、加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质；4、离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；5、乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA；6、用无DNase的RNase去除残余的RNA（选择）。,碱裂解法：,2、噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,大肠杆菌的l噬菌体DNA,噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。,l-DNA载体的构建：缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,l-DNA载体的构建：插入型载体,载体长度37kb,插入片段大小：0-14kb,插入位点,插入片段,体外包装,体外包装,如：lgt系列载体,l-DNA载体的构建：取代型载体(Blattener),最小装载长度10kb,载体长度26kb,最大装载长度25kb,插入片段,插入片段,体外包装,体外包装,如：Charon系列载体,l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一酶切位点。,l-DNA载体的构建：加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。l-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量。l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。,l-DNA作为载体的优点：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。,l-DNA重组分子的体外包装：,3、柯斯质粒,柯斯质粒（cosmid）一类人工构建的含有l-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。,cos,ori,Apr,Tcr,pHC79,lfragment,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。能像质粒那样在受体细胞中自主复制。装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围。不能体内包装，不裂解受体细胞。,考斯质粒载体的特点：,二基因工程的工具酶,限制性内切酶DNA连接酶其它酶类,1、限制性内切酶,限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶.例如:EcoRI可以识别5.GAATTC.33.CTTAAG.5粘性末端,限制性内切核酸酶：在特异位点上切割DNA分子分三类，常用为类酶识别序列呈回文对称命名：酶来源的生物名称缩写属名-种名-株名-发现次序,限制性核酸内切酶的命名,属名种名株名,HindIII,Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株,5-GAATTC-33-CTTAAG-5,5-GTTAAC-33-CAATTG-5,EcoR的识别序列,Hae的识别序列,5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN33NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5,5NNNNNG3NNNNNCTTAAp,EcoR的识别序列和酶切切口（粘端）,pAATTCNNNNNN3GNNNNNN5,5NNNNNNGTTAACNNNNN33NNNNNNCAATTGNNNNN5,5NNNNNGTTpAACNNNNN33NNNNNCAApTTGNNNNN5,Hae的识别序列和酶切切口（平端）,限制性内切酶识别特定的碱基序列,同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。,2、连接酶（DNAligase）,该酶常从噬菌体的受感细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二酯键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。,T4噬菌体,电镜下的噬菌体,T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）15：15/6h；12/8h；8/12h；,连接方式：相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接,粘端连接,CCGGCCGG,GGCCGGCC,CGGC,CGGC,CGGC,CGGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCTAGCT,TCGATCGA,同聚物加尾连接,5,5,5,5,AAA,AAA,TTT,TTT,TdT酶,连接酶,人工接头连接,BamHI,BamHI,BamHI,3、反转录酶（reversetranscriptase）,这类酶来自于反转录病毒，它可以为模板，催化合成。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。,4、DNApolI及Klenow片段,该酶常用于制备探针，探针的制备方法是采用所谓的缺口平移（nicktranslation）法制备的