第九章 凝胶过滤及.ppt

第九章凝胶过滤及离子交换层析介质,广东省韶关学院生物科学系,第一节概述,自茨维特1903年发明色谱法以来，该方法已经广泛用于生物分子的分析分离与制备。在蛋白质、多糖、天然产物的分离纯化与除热源等方面得到了广泛的应用。其中的填料色谱介质，是决定色谱分离效果的主要、最重要的因素。目前，各个国家的许多公司，均有专门的色谱出售。有的用于分析效果好，有的适合大规模制备使用。,60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的研制成功，使色谱实现机械化、自动化操作，提高了操作的复现性。这类全自动的生产规模级的层析系统（如瑞典Pharmaciacom.的Bioprocess、），能高速处理大量样品，流速从4-20L/h到40-400L/h，能满足各类规模生产的需要。他们的填料特点是：1、适用于实验室和大规模生产，重现性高。2、易清洗、消毒和再生，理化性质稳定，使用寿命长。3、易装柱，高工作容量，高流速，利于工业化生产。,1975年Small提出了离子交换色谱法，1981年Jorgenson创立了毛细管电泳法。20世纪90年代后，出现的扩张床吸附技术，通过一步纯化，达到萃取、浓缩和初步纯化的目的，所用的填料是STREAMLINE介质一种以Sepharose为基架的介质。2004年GEHealthcare(原安玛西亚公司)推出的新一代EBA扩张柱STREAMLINEDirect柱，消除了样品和气泡容易堵在筛网下的问题。各种用于大规模大分子分离纯化生产的色谱方法见表9-1，需注意他们的分离原理、特点和应用。,第二节凝胶过滤介质,一、凝胶过滤概念：又称排阻层析或分子筛方法，是利用凝胶网状结构，根据分子的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化的方法。凝胶过滤的优点：介质稳定，不带电，不与溶质反应，蛋白质不易变性。适应面广，对各种大小的分子均适用。设备简单，易操作，耗时少，可连续操作。,常用于脱盐和分级分离。分级分离是将分子大小相近的物质分开，且要选择合适的凝胶，单次上样量小，一般为床柱体积的5%-10%。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开二、凝胶介质应具备的条件优良的凝胶介质是获得良好分离效果的前提，介质必须：1、惰性材质，不与溶质和溶剂反应。2、没有或极少的非特异性吸附，提高回收率。消除带电基团。3、介质内孔径大小分布均匀，孔径分布要窄，才能保证分离效果好。4、凝胶珠大小均匀，均一性好。细粒填料能提高柱效。5、机械强度高，易于消毒，能反顾使用。,三、凝胶介质的种类主要为人工合成大分子和天然多糖类1、多糖类骨架这类多糖有纤维素、葡聚糖和琼脂糖这类介质生物相容性好，亲水性强，不会导致生物分子变性失活。由琼脂糖和葡聚聚合而成的糖新一代复合凝胶Superdex高效过滤介质，使生产效率进一步提高，从小规模过滤延伸到大规模生产。2、合成大分子骨架介质这类介质有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇系和含羟甲基酰胺类等。克服了天然介质易受微生物侵蚀的缺点，保留了多糖骨架亲水的优点。3、天然大分子与合成高聚物构成混合骨架的介质既亲水抗微生物侵蚀，又有很好的生物相容性和刚性。,凝胶层析分类,系列名称分离范围颗粒大小应用Superdexprepgrade系列Superdex30PG小于100002444微米小肽Superdex75PG3000700002444微米一般蛋白Superdex200PG100006000002444微米单抗、大分子蛋白Superose系列Superose6PG5000500000020-40微米蛋白、多糖、核酸、病毒Superose12PG100030000020-40微米蛋白、多糖、核酸SephacrylHR系列SephacrylS-10010001000025-75微米肽类、小蛋白SephacrylS-200500025000025-75微米一般蛋白SephacrylS-30010000150000025-75微米抗体等较大蛋白SephacrylS-4002800000025-75微米多糖、蛋白多糖、脂质体SephacrylS-5006000000025-75微米1078bp的DNA片断SephacrylS-100010000000040-105微米G25。DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25。分离大分子用G50，小分子用G25。Sephadex不溶于水和有机溶剂。中性pH可120度高压30Min。3、琼脂糖系Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂4、聚乙烯醇系全合成的基质，结构稳定，离子强度、pH变化的影响不大。,5、,苯乙烯系离子交换树脂的结构,CH2CHCH2CHCH2CHCH2CH,SO3-H+,SO3-H+,SO3-H+,CH2CHCH2CHCH2CHCH2CH,SO3-H+,CH2CHCH2,SO3-H+,HC=CH2HC=CH2,m,+n,HC=CH2,通用型中苯乙烯为骨架的占70%。但粒度较大，0.35-1.25mm。所具有的特点：低压系统中分辨率最高颗粒大小完全均一理化性质稳定极低的非特异性吸附，回收率高，重复性好。6、扩张床吸附技术的STREAMLINE系列属流化床的一种特殊情况，上世纪90年代发展起来的。同时具有层析、离心和超滤的效果。工作液从下向上流动。7、MonoBeads系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，有3种类型的功能基，粒度分布窄（10um）具有和Source系列相同的优点，但动态载量