胶体金快速免疫诊断技术PPT课件

免疫层析快速诊断技术，层析技术优势：简单领域快速，1。打开包装，取出试纸，2。将其直接插入待测样品中，3。直观地读出结果(在3-10分钟内)。与常规诊断方法相比，该技术的应用、试纸条组成结构、检测线(t线)、控制线(c线)、胶体金垫、吸水滤纸、样品垫、硝酸纤维素膜(硝酸纤维素膜)、色谱方向、聚氯乙烯基板，有4个组成部分：1、吸水纸(样品垫)。玻璃纤维膜(胶体金垫)。干燥的金标记抗体(流动带)被吸附在膜上。(3)硝酸纤维素膜，涂有抗原或抗体条和质量控制材料条(检测条),可与标记物直接反应。(4)、吸水纸。上述部件首尾相连。基本原理是将已知的特异性抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上的某个区域作为检测区域。将样品滴入样品区后，样品通过毛细管作用移动到玻璃纤维膜，金标记的复合物溶解并与样品反应形成复合物，复合物继续移动到硝酸纤维素膜的检测区。金标记的复合物在检测区被抗原或抗体捕获，并呈现红色带。如果样品中没有待检测的抗原或抗体，则不会发生结合，即不会出现显色。通常，对应于金标记的结合物质的抗原或抗体被固定为硝酸纤维素膜检测区域附近的质量控制带。无论样品中是否有任何待检测物质，都应显示质控线。如果没有物质，检测失败。整个过程一般在15分钟内完成，操作简单快捷，无需任何仪器。对免疫层析的检测原理进行了分类。胶体金免疫层析法检测用脑膜炎球菌抗体胶体金标记的兔抗人IgG(间接法)。样品中的脑膜炎球菌抗体与用胶体金标记的抗人IgG结合，沿着硝酸纤维素膜移动，与包被中的脑膜炎球菌抗原结合，出现红色反应线。免疫层析检测原理(双抗体夹心法)(以人绒毛膜促性腺激素检测为例)、人绒毛膜促性腺激素亚基抗体Y2、山羊抗小鼠二抗固定在硝酸纤维素膜上，金标记的人绒毛膜促性腺激素亚基单克隆抗体Y1固定在玻璃纤维素膜上。免疫层析试验(竞争反应)的原理(以吗啡试验为例)、吗啡结合物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定在膜试验区。金标记的单克隆抗体与吗啡缀合物和尿液中的吗啡竞争结合，最低检测量为300ng/ml。结果测定：阳性():吗啡浓度高于300毫克/毫升，质控区出现紫带，试验区无紫带。当吗啡浓度高于300ng/ml时，胶体金抗体与吗啡完全结合，因此不与吗啡结合物结合，并且没有紫带。阴性(-):吗啡低于300毫克/毫升。有两个紫色带，一个在测试区，另一个在对照区。当吗啡浓度低于300ng/ml时，胶体金抗体不能与吗啡完全结合。这样，胶体金抗体将在色谱过程中被固定在膜上的吗啡缀合物结合，并且在测试区域将出现紫色带。无效：质控区没有出现紫色带，表明操作过程不正确或试剂盒变质和损坏。抗体、不同来源的：小鼠抗体、不同类型兔、羊抗体的：单克隆抗体、多抗体浓度的：浓缩液3360不含盐、抗原和抗体的生物原料、抗原抗原、全病毒抗原的重组抗原，胶体金是氯金酸(HAuCl4)在白磷、抗坏血酸、柠檬酸钠等还原剂的作用下聚合而成的特定大小的金颗粒，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，称为胶体金。根据胶体金的一些物理性质，如高电子密度、颗粒大小、形状和颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，胶体金被广泛应用于免疫学、组织学、病理学等领域胶体金的制备，胶体金的制备，通过柠檬酸三钠还原法在15纳米、18纳米-30纳米、40纳米或50纳米制备胶体金颗粒，取100毫升0.01%高氯酸水溶液，加热至沸腾。根据需要快速加入4毫升、2.5毫升、1毫升或0.75毫升1%柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸约5分钟，出现橙红色。如此制备的胶体金颗粒的颜色和颗粒关系分别为15纳米、18-20纳米、41纳米和50纳米。最佳标记粒径为40纳米。1%柠檬酸三钠ml0.300.450.701.001.502.00金溶胶颜色蓝色灰紫色灰紫色红橙色吸收峰(nm)220240535525522518直径颗粒(nm)14797.571.54024.515。胶体金的鉴定，1。视觉观察：在阳光下仔细观察胶体金的颜色可以粗略估计出金颗粒的大小。同时，好的胶体金应该是透明的。如果它是混浊的或漂浮的，则表明有更多的凝集颗粒。2.分光光度计扫描吸收峰值波长来估计金颗粒的大小。3.金颗粒的大小可以通过电子显微镜精确测定。免疫胶体金的制备胶体金在弱碱性环境中带负电荷，能与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合。由于这种结合是静电的，它不会影响蛋白质的生物学特性。蛋白质：1的预处理。蛋白质应该用低离子强度的水进行透析，以去除盐分。盐成分会影响胶体金对蛋白质的吸附，并使胶体金沉淀。应该避免磷酸盐离子和硼酸盐离子。2.使用微孔滤膜或超速离心去除蛋白质溶液中的微粒。3.胶体金在蛋白质上的吸附主要取决于酸碱度。在接近蛋白质等电点或微碱性的条件下，两者很容易形成牢固的结合。如果胶体金的酸碱度低于蛋白质的等电点，它将聚集并失去结合能力。蛋白最适量的测定待标记蛋白(小鼠抗人IgG)储存液连续稀释后，分别加入0.1毫升至1毫升胶体金溶液，另设一个无蛋白对照管，5分钟后加入0.1毫升10%氯化钠溶液，混匀，静置2小时。结果判断：对照管或蛋白添加量不足，胶体金由红色向蓝色聚集。如果添加的蛋白质质量达到或超过稳定量，胶体金将保持红色，不稳定的金溶胶将沉淀。对照试管(不含蛋白质)和每一个加入的蛋白质量不足以稳定胶体金的试管将显示红色到蓝色沉淀的现象。然而，添加蛋白质量达到或超过最小稳定量的试管仍然保持红色。用于稳定1毫升胶体金溶液红色的蛋白质的最小量是标记蛋白质的最小量，在实际工作中可适当增加10%。在这种情况下，蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂以避免凝集。聚乙二醇(分子量20000)和牛血清白蛋白通常被选为稳定剂。加入量：5%牛血清白蛋白使溶液的最终浓度为1%；将1%聚乙二醇加入到总溶液的1/10中。(1)用0.1摩尔/LK2CO3或0.1摩尔/LHCl将金溶胶调节至所需的酸碱度。(2)将最佳标记量的蛋白溶液加入100毫升金溶胶中，搅拌2-3分钟。加入5毫升1%聚乙二醇20000溶液。(4)以10000 100000 g离心30 60分钟，小心吸取上清液(避免倾倒)。(5)将沉淀物悬浮在一定体积的含有0.2 0.5毫克/毫升聚乙二醇20000的缓冲溶液中。离心沉淀后，用相同的缓冲溶液恢复。合适的浓度是A540nm纳米=1.5。在4保存。包被的金溶胶也可通过凝胶色谱在SephadexG-200柱上浓缩和纯化，用含0.1%牛血清白蛋白的缓冲液洗脱。一般来说，包被有免疫球蛋白的金溶胶洗脱液的酸碱度为8.2。在上述操作中，应注意任何溶液中都不应含有杂质颗粒，这可以通过高速离心或微孔膜进行预处理。胶体金蛋白缀合物的质量鉴定平均直径的测定：将金标记的蛋白试剂浸入镍粉中一般应用液体的OD520应为0.2 0.4。金标记蛋白特异性和敏感性的测定：采用免疫金法和微孔膜银染色法。可溶性抗原(或抗体)被吸附在载体(滤纸、硝酸纤维素膜、微孔滤膜)上，用胶体金标记的抗体(或抗原)被直接或间接染色，并产生银以检测相应的抗原或抗体，并鉴定金标记蛋白的特异性和敏感性。胶体金蛋白偶联玻璃纤维素膜制备，胶体金标记的小鼠抗人IgG在玻璃纤维素膜中浸泡10分钟，取出至37度烘箱中干燥，热封，置于4摄氏度冰箱中备用。(实验阶段)用喷雾点仪器将胶体金标记的小鼠抗人IgG喷雾在玻璃纤维素膜上，并在真空中干燥2h。(生产阶段)，选择数控膜，数控膜选择爬升速度(？秒/4厘米)的灵敏度，通过相同的T线喷点位置的影响，金溶液通过速度快的薄膜慢的薄膜。然后通过速度越快，物质包裹在T线中的反应时间越短，读数越快，灵敏度越低。相反，反应时间越长，读数越慢，灵敏度越高。同时，另一个问题是，反应时间越长，非特异性结合的可能性越大，因此长期反应可能不会真正提高灵敏度。因此，阅读时间/反应敏感性/非特异性结合之间存在平衡。不同膜制造商(Whatman、Millipore、Sartorius)的产品约为：135和180s。抗原和抗体涂有固相NC膜制剂。包被的脑膜炎球菌抗原浓度筛选(T线)抗原用PBS梯度稀释。释放后，用1l移液器涂于硝酸纤维素膜上，在37干燥1小时，备用。包被的抗小鼠IgG浓度筛选(c线)抗小鼠IgG抗体用PBS梯度稀释，释放后用1l移液管点样于NC膜上，37干燥1h。溶液喷雾点(喷雾点演示：BIODOTXYZ系列喷雾点仪器)，CT线溶液预处理：1。过滤，0.22um孔径过滤膜2。离心10，000转/分钟CT线喷雾点法与接触划线点法相比，因为划线类型是一种将抗体划线到膜表面的软管，并且膜本身的物理性质是软而脆的，划线管会在其表面留下标记。划痕很容易形成对色谱金标记化合物的抗性，从而导致假阳性。与干燥方法相比，37干燥4h，颗粒性强，中部易发白，外围较深。低温真空干燥3小时：颜色均匀，两端稍浅，有一定的弹性。试纸条组装完毕，在干燥室准备好吸水滤纸、样品垫、聚氯乙烯地板，在聚氯乙烯地板的中心粘上包裹好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上边缘粘上吸水滤纸，硝酸纤维素膜下边缘粘上胶体金垫，胶体金垫下边缘粘上样品垫，切割完成后机器将粘好的试纸条切成4毫米宽的试纸条。然后将测试条密封在铝箔袋中，完成产品组装。条带切割包装，条带切割(演示：BIODOTCM4000条带切割机)包装，质量控制，1。用30份阴性参考血清检测特异