植物体内转化酶活性的测定

植物体内转化酶活性的测定转化酶又称蔗糖酶(D呋喃型果糖苷一果糖水解酶)，是一种水解酶。植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。它能将植物体内的主要同化产物蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。【原理】转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。通常，在测定过程中，溶液的pH对酶活性影响很大。不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH值。转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa约为7，另一个PKa约为3。不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH也不同(最适pH在7.0左右的为中性转化酶，最适pH在7.0以下的为酸性转化酶)。所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH值。【材料、仪器与试剂】1材料：植物组织2试剂：（1）提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl (PH7.0) 缓冲液，内含5 mmol/L MgCl2, 2 mmol/L EDTA-Na2,2% 乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSA），2%PVP，5 mmol/LDTT。（2）透析缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl (PH7.0) 缓冲液，内含2.5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EDTA-Na2,1% 乙二醇，1 mmol/L DTT。（3）酶反应液：80 mmol/L乙酸-K3PO4(pH4.7和pH7.0)缓冲液，内含50 mmol/L蔗糖。（4）葡萄糖标准液：1 mg/mL。（5）3，5-二硝基水杨酸试剂：精确秤取1g 3，5-二硝基水杨酸，溶于20 ml 2 mol/LNaOH溶液中，加入50 ml蒸馏水，再加入30 g酒石酸钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 ml。盖紧瓶塞，勿让CO2进入。若有浑浊可过滤后使用。材料：小麦叶片、籽粒。3设备冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），1 mL移液管5支，5 mL带塞试管10支。【方法与步骤】1酶的提取：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml 提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml 装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml 备用。2酶反应：取3支5 mL具有试管，加入0.95 mL反应液和50mL 透析后的酶液，30水浴中反应10 min中止反应。用煮死酶液作对照（煮沸10min）。3还原糖含量的测定：往各反应试管中再加3，5-二硝基水杨酸试剂1 mL，沸水浴5 min，冷却至室温，于540nm比色测定生成的还原糖量。4标准曲线制作：取7支5 ml具塞试管，编号，按下表配置加入各种试剂液，并按上述步骤3进行，测定其吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线，计算反应生成的葡萄糖量：管号12345671mg/mL葡萄糖标准液（ml）00.10.30.40.60.81.0加蒸馏水量（ml）1.00.90.80.60.40.203，5-二硝基水杨酸(ml）1.01.01.01.01.01.01.0葡萄糖含量（mg）00.10.20.40.60.81.0A5405.结果计算：酶活力以mg 葡萄糖g-1FWh-1 表示。酶活力（mg 葡萄糖g-1FWh-1）=【结果与计算】转化酶的活性用还原糖量(mggfwh)表示，计算公式如下：C表示从标准曲线查得的葡萄糖量（mg）；FW表示组织鲜重（g）；t表示反应时间（h）；Vt表示提取酶液的总体积（mL）；Vs表示测定时取用酶液体积（mL）；n表示提取液测定中的稀释倍数。转化酶的测定转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。试剂：1、10%蔗糖溶液2、葡萄糖标准液（500g/ml）3、0.05mol/l的磷酸缓冲液4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：管号123456葡萄糖原液量（ml）00.40.81.21.62.0加蒸馏水量（ml）2.01.61.20.80.40葡萄糖浓度（g/ml）0100200300400500在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定5