HPLC方法开发.ppt

系统方法开发,开发方法之前应明确以下各项分离目的样品性质和需要的预处理检测方法开发分离方法的步骤选择合适的HPLC方法开始建立方法改善分离检查问题完善方法,有关样品组分和性质的重要信息,现有组分的数目组分的结构以及具有的官能团组分的分子量组分的pKa值样品基质的性质：溶剂,填充物等要检测组分在样品中的浓度范围样品溶解度,分离目的,是分析还是回收样品组分？是否以知样品所有成分的化学特性，即是否需要定性分析？是否需要解析出样品的所有成分(例如,对映异构体,非对映异构体,同系物,低聚物,痕量杂物)?如需定量分析，需要多高的精密度？,分离目的,本法需用于几种样品剂型(如原料,制剂,环保样品等)？未来使用该方法分析的样品数的多少？未来使用该方法的实验室拥有的HPLC设备和技术能力？,样品的性质以及是否要进行预处理,来自不同形态的样品:可以直接进样的溶液需要稀释，缓冲，或者加入第二种溶剂的溶液能溶解在流动相中的固体物配制样品前应称重含有能引起柱效损失的物质的样品-要求萃取或过滤被分析物中含有不溶物-要求萃取或过滤,检测方式,根据不同的分离目的需要不同的检测器.测量单个或少量的化合物时,理想的检测器应该仅仅对目标物有响应而对其他物质没有响应高选择性和高灵敏度对于定性分析和制备色谱,理想的检测器是通用型的检测器,这样混合物中的每一种物质都能被检测出来.并且不需要特别高的灵敏度,检测器,检测器化合物类型UV/PDA最常用的检测器不适用于烷烃和糖类RID通用型检测器荧光检测器适用于能产生荧光的物质具有高选择性和灵敏度电化学检测器适用于易氧化和降解的化合物具有高灵敏度和选择性电导检测器适用于可电离的化合物，如有机酸和无机酸柱前或柱后衍生化,选择一种HPLC模式,对于大多数的样品，开发方法经常是从反相模式开始的.离子对反相模式和正相模式是第二选择.具有以下任何性质的样品经常要求一些特殊的条件.大分子量的样品,如聚合物,碳水化合物或蛋白质含有光学异构体的混合物(对映体)含有其他异构体的混合物含有无机盐的样品,影响HPLC分离的反相条件,不同分离条件优先选择柱尺寸(长度,I.d.)15,25cmLx2-6mmID,粒径3-5um固定相C-8orC-18流动相溶剂A/BWater/ACN%-B不定的缓冲液(化合物,pH,浓度)10-100mM磷酸盐,pH2-7添加剂(eg.,离子对试剂,氨)阳离子中加1-20mM高氯酸钠阴离子中加1-20mMTBA(四丁基铵）流速0.1-2ml/min温度10-60oC样品体积100ul质量100ug,主要HPLC方法的特性,离子交换模式流动相：水相，另以缓冲液控制pH值色谱柱:阳离子或阴离子交换柱尺寸排阻色谱流动相：水相(凝胶过滤)有机相(凝胶渗透)色谱柱:二醇基（凝胶过滤用）聚苯乙烯或硅胶（凝胶渗透用）,分离无机离子混合物的首选(离子色谱法)，分离核酸和蛋白质以及有关的化合物的良好的选择.分离高分子量样品，如蛋白质和聚合物的良好首选，也可用作测量G分子量的分布,次要HPLC方法的特性,方法/特点/色谱柱,何时应用此方法,改善分离,两个相邻的峰达到基线分离，其分离度Rs1.5.对简单混合物，应使分离度Rs2对含10个或更多成分的样品,分离度的要求可降到Rs1,开发HPLC方法的分离目的,目的内容分离度精密和抗干扰的定量分析要求Rs1.5分离时间小于5-10min时，日常工作较理想定量含量测定：RSD1%;要求不高或痕量分析,RSD5%压