生物技术药物制剂与疫苗

生物技术药物制剂和疫苗，JARIOS大连理工大学，Contents，生物技术药物制剂概要，蛋白质类药物制剂的处方和技术，蛋白质类药物的新给药系统，蛋白质类药物制剂的评价方法，4，1，2，3，section1，section 一、概况、生物技术：应用生物体或其组成部分，在最佳条件下生产有价值的产物或进行有益过程的技术。 主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。 生物技术药物制剂是指利用现代生物技术，由某些微生物、植物、动物生产的药品。生物技术药物的研究概况、生物技术药物制品，目前国内外销售的约40多种，研究中的有数百种，这些药物都是肽类和蛋白质类药物。 我国销售的基因工程药物和疫苗是1995年白细胞介素-21996年1b-干扰素2a-干扰素2b-干扰素，1997年颗粒球菌落因子红细胞生成素，1992年乙型肝炎疫苗，生物技术药物蛋白质的组成和一般结构蛋白质是许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键连接而成的多肽链。 蛋白质的高级结构为二级、三级和四级结构。蛋白质的理化性质，1，蛋白质的一般理化性质旋光性：根据螺旋结构，通常右旋紫外吸收：苯核在280nm处最大吸收，氨基酸在230nm处强力吸收蛋白质的两性性质和电性质：在不同的pH下变成阳离子、阴离子或两性离子蛋白质不稳定性共价键对不稳定蛋白质水解蛋白质氧化外消旋作用的二硫键切断和交换，非共价键不稳定性：宏观沉淀表面吸附蛋白质的改性，蛋白质的理化性质，蛋白质稳定性对蛋白质类药物的制剂研究、生产、贮藏等极为重要。蛋白质类药物评价方法、液相色谱： RP-HPLC、IEC、SEC光谱法：UV、吸收光谱、ORD、CD、荧光、IR、拉曼光谱电泳： SDS-PAGE、IEF、EC生物活性测定和免疫测定：重组DNA和杂交瘤生物活性检测利用体内模型、体外组织和活性蛋白多肽的特异生物学反应，用剂量(或浓度)效应曲线进行定量(绝对量或比活性单位)。 免疫测定通常采用免疫化学法，探讨蛋白质药物不稳定的原因，发现开发蛋白质类药物需要多种分析方法。二、蛋白质类药物制剂的处方和技术，蛋白质类药物的一般处方组成的蛋白质类注射剂，溶液型注射剂：易用，冻干粉注射剂：需要稳定低温保存，但复杂的液体剂型蛋白质类药物稳定化方法是改造其结构加入适当的辅助材料(通过加入各种辅助材料(蛋白质类药物制剂研制的关键是解决这类药物的稳定性问题。 注射给药需要采用合适的辅助材料，设计合理的处方和工艺，解决生物利用度而非注射给药的问题。 蛋白类药物稳定剂为缓冲液：柠檬酸钠-柠檬酸缓冲剂、磷酸缓冲类表面活性剂：吐温80糖或多元醇：蔗糖、海藻糖山梨醇等盐类：一般的NaCl聚乙二醇类： PEG200、300、400、600、1000高分子化合物： HSA (人类组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸盐酸盐等金属离子：钙、镁、锌等固体蛋白质药物稳定性和工艺冻干蛋白质药物制剂应考虑的问题：选择合适的辅助材料影响冻干过程参数的冻干保护剂：甘露醇山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖等喷雾干燥蛋白质药物制剂：喷雾干燥技术广泛应用于蛋白质类药物控制剂、吸入剂、微球制剂等新型给药系统的开发。喷雾干燥过程中加入蔗糖等稳定剂，可以提高氧血红蛋白的稳定性。 缺点是操作中损失大、水分含量高、高分子聚合物中蛋白质药物稳定化、蛋白质药物稳定性药物不稳定性通常在制备、贮藏和释放过程中产生蛋白质药物不稳定机制的水溶性或水不溶性凝集； 水解脱氨和氧化在使用W/O/W复乳溶剂挥发法制造PLGA微球时，通过添加稳定剂BSA和海藻糖，可以有效地提高蛋白质的稳定性。封入聚合物的蛋白质药物在释放过程中影响稳定性的因素含水量微环境对pH聚合物表面吸附的次要因素：水溶性低聚物、渗透效果、蛋白质与聚合物之间的直接反应、 简化稳定性研究的途径和方法选择模型蛋白质：例如以核糖核酸酶a为模型药物研究蛋白质不稳定机制模拟和修饰聚合物中蛋白质结构：模拟蛋白质存在的不利条件和不稳定机制，提取蛋白质选择不同的聚合物骨架：采用大几何形状的微柱，简化蛋白质稳定性的研究与评价。由于湿度的不稳定性使固体药物中的水分含量发生变化，是蛋白质处于非伸展状态，直接阻断其不稳定的机制。 锌离子和人生长激素形成不溶性沉淀可加入提高蛋白质稳定性的添加剂，改变聚合物吸水量的两种常见共价键机理：固体蛋白在湿润环境中二硫键破环通过甲醛凝聚的过程， 酸诱导的蛋白质不稳定性提高PLGA封入蛋白质稳定性的最直接方法是调节处方提高微环境的pH值。 避免酸诱导的BSA物理聚集的方法可增加聚合物的渗透性，释放PLGA水解产物的水溶性酸，降低聚酯的分解速度，中和聚合物分解产物的弱酸，三、蛋白质类药物新型给药系统、新型注射(移植)给药系统的临床经验许多蛋白质类药物在体内血浆半衰期短，清除率高，因此需要延长在体内的平均停留时间，改变蛋白质在体内的药动学，有时需要建立非零级脉冲式释放系统(疫苗等)。 为了满足这些要求，可以化学修饰蛋白质分子，控制蛋白质向血流的释放速度。 目前用PEG修饰蛋白质分子，延长血浆中蛋白质药物的半衰期。 例如腺苷酸脱氨酶(adenosinedeaminase，ADA )采用形成PEG-ADA的方法治疗因缺乏ADA而引起免疫缺陷综合征的患者，该药已获准在FDA中生产。 缓释微球制剂： FDA首批批准的蛋白质类药物微球制剂是乙酸亮氨酸(leuprolideacetate )聚丙交酯乙酯微球。 该微球供肌内注射，用于前列腺癌的治疗，可控制释放达到30d的时间，改变了每天注射普通注射剂的传统，使用方便。微球制剂常用制备方法复乳中干燥法(干扰素、白介素、亮脯氨酸、人生长激素、环孢素及红细胞生成素(EPO )等)低温喷雾提取法喷雾干燥法超临界提取法脉冲式给药系统：疫苗或毒素等抗原蛋白， 白细胞介素1(IL-1)PLGA微球的制备：LimorChen等采用改良的复乳溶剂挥发法制备。 具体方法是将20 mg牛血清白蛋白(BSA )、50l含gil-18.5g的水溶液和0.5ml含plga200mg的二氯甲烷混合，用探针式超声波乳化(56w)30s将该初乳分散在1ml用二氯甲烷饱和的1%(w/v)PVA水溶液中， 在50ml0.1%(w/w)PVA水溶液中加入5min搅拌，再加入含有10%(v/v)2-丙醇的PVA溶液50ml，将二氯甲烷萃取到外水相中，连续搅拌30min后，以离心10min收集微球，冷冻干燥流动性粉末状微球皮下注射微球后，不足10m的微球容易被巨噬细胞吞噬，因此需要将微球的粒径控制在10m以上。 制备过程中表面张力影响il-1的活性，加入0.5%(w/w )磷脂酰胆碱(PC )保护il-1，显着减少微球粒径。 微球体外释放度试验表明牛血清白蛋白和白细胞介素1在30分钟内分别释放38%和63%，40天内分别释放75%和100%。 扫描电镜显示，突然释放的过程与骨架溶解过程同时进行。 研究非注射给药系统、非注射途径给药系统有助于提高患者依从性。 蛋白质和多肽类药物的非注射给药方式包括鼻腔、口服、直肠、口腔、经皮和肺部给药。 目前，最有应用前景的是鼻腔给药，口服是最受欢迎的给药途径，但难度很高。 蛋白质和多肽类药物非注射给药系统中存在的主要问题是药物渗透黏膜能力差，易受酶解，生物利用度低。 提高生物利用度的方法：化学修饰药物，前驱药物使用吸收促进剂采用离子电渗法给皮肤注射酶抑制剂，鼻腔给药系统鼻腔黏膜的特点：鼻腔给药系统存在的问题：吸收促进剂、动静脉和毛细血管丰富，大量微绒毛、渗透性高，酶少，有利于药物的吸收， 分子量大，药物渗透性差，生物利用度低，吸收不规则，局部刺激性，妨碍绒毛运动，长期给药毒性，胆酸盐类，脂肪酸及其酯类，其他。胰岛素鼻腔给药系统已经得到广泛研究，胰岛素不使用催化剂而从鼻腔给药的生物利用度不到1%，但使用葡萄糖酸酯作为吸收催化剂，其生物利用度将提高到10%30%。 近年来有报告称，胰岛素为淀粉微球，微球直径为45m，以0.751U/kg和1.71U/kg的量喷入小鼠鼻腔，达到峰值时为8min，3040分钟后，血糖分别下降40%和64%，维持时间为4小时，生物利用度约为30%。口服给药系统(胰岛素)， 存在胃酸催化分解的问题受到胃肠内酶分解后对胃肠粘膜的透过性差的肝脏的最初作用的微乳液制剂：例如自乳化胰岛素油溶液纳米胶囊和纳米粒子：例如胰岛素多异氰酸酯纳米胶囊胰岛素肠溶胶囊生物粘接材料和肠溶性材料的联合应用技术：壳聚糖胰岛素脂质体新型吸收促进剂的应用： SNAC，其他给药系统、直肠给药系统的特点：水解酶活性低、pH接近中性、避免肝脏最初效果的一般吸收促进剂结肠定位给药系统(OCDDS ) 采用口腔黏膜给药系统：避免胃肠消化和肝脏最初的效果，经皮给药系统：离子引入技术：指电荷和中性分子在电场中向皮肤转移的过程。 肺部给药系统：存在问题：长期给药后安全性评价促进肺吸收分子大小限值吸收的措施稳定的蛋白质药物处方设计方法，四是蛋白质类药物制剂评价方法， 4.1制剂中药物含量测定提取工艺：含不溶性凝集蛋白质的蛋白质总量水解工艺：碱性条件下水解最常用的含量测定方法：紫外分光光度法反相高效液相色谱： RP-HPLC、IES、SEC法BCA法和MicroBCA法4.2制剂中药物活性测定、酶免疫体外药效学方法利用体外细胞与活性蛋白多肽的特异生物学反应，按剂量(或浓度)效应曲线进行定量。 是制定药物制剂质量标准的最基本方法。 体内药效学方法动物或人体给药后反应的药效学反应。4.3制剂中药物体外释放速度的测定、蛋白质药物体内释放速度的测定方法的具体方法是，将一些试验组的微球(每个试验组设置一些取样点)放入一定量的溶出介质中，放入37的振动孵化箱中，定量离心分离测定微球中药物含量。 影响释放的主要因素有介质pH、离子强度、赋形剂、转速、温度等。影响药物释放行为的因素(以微球为例)、影响聚合物释放药物的机制：扩散机制和分解机制聚合物组成影响释放聚合物分子量影响释放聚合物结构影响释放聚合物与药物相互作用对释放的影响、影响药物释放、剂量影响释放的高药物稳定性影响释放的蛋白质类药物易聚集在微球内部称为不溶性沉淀，影响释放药物。制备技术对释放的影响，复乳法制备技术：制备初乳时蛋白质不可逆地凝聚，释放不完全。 部分无水法制备工艺低温喷雾提取法制备工艺喷雾干燥法制备工艺加成剂对释放的影响，4.4制剂稳定性研究：物理稳定性和化学稳定性4.5体内药动学研究：对非静脉给药缓释制剂的体内药动学试验考虑选择放射标记法测定血浆中药物的量，该方法灵敏度高，多4.6刺激性和生物相容性研究：根据我国SFDA (statefoodanddrugadministration )药品注册管理方法的规定，皮肤、粘膜及各种口腔药物需要进行局部毒性和刺激性试验，各种注射(植入)途径除了对药型进行局部毒性和刺激性试验外，还可以使用辅助材料的生物体.参考文献，1姜忠义、高蓉、许松伟等.药物蛋白的聚乙二醇修饰.中国药学杂志，2002，37 (6):409 2瞿文，陈庆华、赵瑞钦等.氨瑞林生物降解性缓释微球注射剂的研究.中国医药工业杂志，2000，31 (1):1414 药剂学.北京：人民卫生出版社19994吴琼珠等.小鼠口服胰岛素复乳后降血糖效果的实验研究.中国医药工业杂志，1990，21:445，Section2疫苗是指用于人体预防接种的疫苗类预防生物制品。 预防接种用的生物制品包括疫苗、疫苗和类毒素。 疫苗(vaccine )分为两类。 原理：疫苗是病原微生物(细菌、立克次体、病毒等)及其代谢产物通过人工减毒、灭活、基因工程等方法制备的预防传染病的自动免疫制剂。 政府、自主、自费、种类、人工主动免疫制剂1 .灭活疫苗(甲肝灭活疫苗、死亡疫苗)2.灭活疫苗(水痘疫苗为灭活疫苗、麻风、腮腺炎疫苗均为灭活疫苗)3.类毒素(白喉毒素、破伤风毒素等) 人工被动免疫制剂1 .抗毒素2 .人免疫球蛋白制剂3 .细胞因子制剂4 .单克隆抗体制剂增加人工被动免疫和人工被动免疫对身体的抗病能力，但后者持续时间短，主要采用治疗， 新型疫苗1 .亚单位疫苗2 .结合疫苗3 .合成肽疫苗4 .基因工程疫苗(1)重组抗原疫苗(2)重组载体疫苗(3)DNA/RNA疫苗(4)重组植物疫苗，儿童注射疫苗，按照中国规定的免疫程序具体来说，乙肝疫苗一般在出生后2天内，每1个月、6个月注射1次，每35年加强注射1次。 目前使用的是基因工程乙型肝炎疫苗，它可以预防已知的乙型肝炎病毒感染。不能接种这种疫苗的婴儿