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文档简介

。实验结果分析,对于外径值分析,一个外径260纳米单位相当于50微克/毫升的双链DNA或40微克/毫升的单链DNA或核糖核酸外径260/280:1.8-2.0脱氧核糖核酸:1.8(核糖核酸:2.0)之比2.03:核糖核酸污染,质粒通常以共价闭合的环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在,在提取过程中,由于机械力、pH值、试剂等,这可能导致DNA链断裂。因此,大多数质粒粗提物含有三种构型的质粒:共价闭合的环状/超螺旋DNA开环DNA(oc DNA);线性DNA(LDNA),质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱,质粒DNA的条带分析,M,pUC19,环状质粒DNA,超螺旋颗粒DNA,问题,质粒DNA的条带分析,电泳条带浓度和纯度的条带拖尾现象(过量样品添加,离子浓度,不完全凝胶凝结),质粒DNA的条带分析,酶消化,实验6 DNA的连接和电泳检测,实验步骤:(1)质粒DNA酶消化(注意:每人一管)将试剂(单位: L)加入到200l薄壁离心管中,按照下表混合缓慢离心,将反应溶液扔到试管底部。37(聚合酶链反应仪)保温1-2小时进行酶消化反应。反应结束后,酶在75灭活10分钟。(2) DNA片段连接(注意:每人一管)取200l离心管,按照下表添加试剂。(ix)混合均匀,点动,离心,将溶液投入试管底部,(ix)将溶液置于12-16调节温度的聚合酶链反应仪中,(ix)保温1-2小时,然后取出电泳检测,(ix)连接,(iii)质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测,琼脂糖凝胶的制备:制备2片0.7%(0.28克/40毫升)和2片1.2%琼脂糖凝胶(0.48克/40毫升)。(注:全班准备了4块口香糖)。1.掌握限制性内切酶的特点,建立酶切体系;2.了解影响酶消化的因素;3.掌握DNA连接酶的性质和连接酶体系的建立;4、了解影响连接反应的因素。本实验的目的是利用DNA重组技术构建DNA重组体,利用限制性内切酶切割DNA和DNA连接酶连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶消化和有效的连接为后续外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。1965年,限制酶WernerArber的发现首次描述了限制现象。哈密尔顿。史密斯是第一个纯化限制性内切酶并鉴定其性质的人。丹尼尔纳坦斯利用这些酶将SV40病毒的DNA切割成特定的片段,并绘制了SV40病毒基因组的“物理图谱”。这三个人获得了1978年的诺贝尔奖。阿尔伯。1972年,保罗伯格等人利用限制性内切酶EcoRI和连接酶获得了第一个重组脱氧核糖核酸分子。它标志着基因工程的开始。Theobelprizeinchemistry 1980,保罗贝格,通过DNA重组技术构建DNA重组体,实验原理-限制性内切酶):一种在特定核苷酸序列水解双链DNA的内切酶。限制性内切核酸酶可以特异性结合到称为限制性内切酶识别序列的DNA序列内或附近的特定位点,并切割双链DNA。一种核酸内切酶,能够识别并切割生物体中的特定双链DNA序列。它是一种能切断外来DNA的酶,也就是说,它能限制外来DNA的入侵并使其失去活力,但它对自己的DNA没有损害,从而保护细胞的原始遗传信息。由于这种切割是在脱氧核糖核酸分子内部进行的,所以被称为限制性内切酶。根据限制性内切酶的识别和切割特性、催化条件以及修饰酶活性的有无,可将其分为三种类型:型、型和型。第二型酶是最常用的DNA重组技术,切割后获得具有粘性末端或扁平末端的线性DNA。型限制性内切酶可以催化宿主DNA的甲基化和未甲基化DNA的水解。然而,第二类限制性内切酶只催化未甲基化的脱氧核糖核酸的水解。第三类切割位点在下游24-26bp。一般来说,名称由微生物属名的第一个字母和第二个字母组成例如,从杆状芽孢杆菌中提取的限制性酶被称为BamH,并且几种具有不同特异性的酶识别从同一细菌菌株中获得的不同碱基序列,可以被编码成不同的数字,例如印地语、HindIII、HpaI、hPAI、MboI、MBOI II等。第二类限制性内切酶的主要特征:识别的最常见的特定核苷酸序列是4或6个核苷酸,少数还识别5个核苷酸和7、8、9、10和11个核苷酸。分子克隆实验中最常用的限制性酶是识别4或6个碱基对的酶。第二类限制性内切酶的识别序列是回文对称序列,即它有一个中心对称轴,从该对称轴上“阅读”在两个方向上完全相同。这种酶有两种切割方式:粘性末端和扁平末端。例如,EcoRI的识别序列是:5 .gaattc.3 3 .CTT aag. 5 ,回文结构的对称轴,限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示,1单位酶是指在指定缓冲液中于37反应60分钟并完全裂解1g纯DNA的酶量。影响酶消化的因素:在酶消化反应中,DNA纯度、缓冲溶液中的离子强度、Mg2等因素都会影响反应。通常,通过增加酶的量和延长反应时间可以实现完全的酶消化。然而,应该注意的是,太多的酶量和太长的反应时间将导致非特异性酶切割(星号活性)。图:重组体、材料、试剂和装置的构建,1。材料和试剂的酶消化反应:标准puc 19(2686 BP)ecor 1及其相关酶消化缓冲液检测:0.5倍电泳缓冲液6倍电泳样品载体缓冲液、金视、琼脂糖、2。仪器:水平电泳装置。台式高速离心机恒温水浴(以聚合酶链反应仪为代表)微量移液器微波炉或电炉紫外透射照相机及其附件、实验步骤:(1)质粒DNA酶消化(注:每人一管)在200l的薄壁离心管中,加入下表中剩余的试剂(单位:l)并混合均匀;缓慢离心,将反应溶液扔到试管底部。37(聚合酶链反应仪)保温1-2小时进行酶消化反应。反应结束后,酶在75灭活10分钟。;电泳检测、(3)质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测,琼脂糖凝胶的制备:制备2片0.7%(0.28克/40毫升),(4)样品添加和电泳检测,1。酶切样品的酶切检测阴性对照(M1): 20l 6X加载缓冲液4L PuC 19标准样品的酶切样品:20l 6X加载缓冲液3L PUC 19酶切样品,(1)。1967年,三个实验室同时发现了脱氧核糖核酸连接酶。它是一种封闭DNA链间隙的酶,利用三磷酸腺苷或脱氧核糖核酸水解提供的能量,催化DNA链的5-磷酸和另一条DNA链的3-羟基之间形成磷酸二酯键。然而,这两条链必须与相同的互补链配对(T4DNA连接酶除外),并且必须是两条相邻的DNA链,才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。有两种常用的脱氧核糖核酸连接酶:来自大肠杆菌的脱氧核糖核酸连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。两者的作用机制相似。实验原理-链接,核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来以获得重组分子。DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5-PO4末端和3-羟基之间形成3,5-磷酸二酯键。当一个DNA片段的5-PO4末端和另一个3-羟基末端相互靠近时,Mg2、三磷酸腺苷在缓冲体系中可以在DNA连接酶的作用下连接在一起形成重组分子。DNA连接酶作用机理,实验原理-连接,酶,焦磷酸,酶-焦磷酸,酶,T4DNA连接酶的作用机制:T4DNA连接酶的作用分为三个步骤:(1)T4DNA连接酶与辅因子三磷酸腺苷形成酶-腺苷复合物。(2)酶-腺苷酸复合物结合到具有5-磷酸基团和3-羟基切口的DNA上以腺苷酸化该DNA。(3)产生新的磷酸二酯键来密封间隙。T4DNA连接酶的活性以维斯单位表示。1Weiss单位是指在37下20分钟内催化1摩尔32P从焦磷酸置换成,-32P三磷酸腺苷所需的酶的量。T4DNA连接酶的最适反应温度为37。为什么在实验中使用12 14摄氏度?1.在粘性末端形成的氢键在低温下更稳定;2.连接反应时间长,酶在低温下不易失活,材料、试剂和仪器,1。材料和试剂连接反应:DNA/EcoT14I:由11个DNA片段组成:19229,7743,6223bp,4254,3472,2690,1882,1489,925,421,74bpT4DNA连接酶及其匹配的10个连接缓冲液检测:0.5TBE电泳缓冲液6个电泳样品载体缓冲液,Goldview,琼脂糖,2.仪器:卧式电泳仪电泳仪、台式高速离心机恒温水浴罐(以聚合酶链反应仪为代表)、微量移液枪、微波炉或电炉紫外透射照相机及其附件,(1) DNA片段连接(注:每人一管)取200l离心管,按下表添加试剂。(DNA连接样品电泳检测,琼脂糖凝胶的制备:制备2片1-2h%琼脂糖凝胶(0.48克/40毫升)。(3)加样和电泳检测,连接样品检测:/EcoT14I样品5l(M2)DNA连接样品:20l恒压电泳:130伏电泳至溴酚蓝凝胶外端1-2厘米处,在:紫外透射仪下观察电泳结果约30-40分钟,并拍照记录。预期的实验结果,质粒和消化样品的预期电泳结果,从左到右:1./EcoT14IDNAMarker2.pUC19质粒3.pUC19质粒消化样品,123,不同构型质粒的电泳行为,线性DNA,超螺旋DNA, 123456,1: -ECOT 14 Digest 2,3:连接产物4: PUC 19质粒5,6。酶促裂解产物,酶切反应中的注意事项,酶的用量,反应时间和体积。oneunitofenzymeisdefineddatocut 1Goufdnain 50 Ulinoneehour反应时间选择。酶消化和鉴定一般可进行30分钟,如果酶减少,反应时间可延长(16小时);反应系统不应太小,常规酶消化通常应保持在10-50微升。酶的体积不应超过总体积的10%(甘油应小于5%)。酶的使用:酶应该永远放在冰上,并且应该是最后一个加入反应系统的酶。使用后,应及时放回冰箱进行DNA制备。待切割的DNA应已从缓冲液中去除,如苯酚、氯仿、乙醇、乙二胺四乙酸、洗涤剂或过量的盐离子。不同的酶需要不同离子强度的缓冲液。使用前,缓冲液应完全溶解并充分混合。均质化:非常重要,注意非振荡反应温度:通常37终止反应:终止溶液,热灭活,酚/氯仿萃取星号活性:在非理想条件下,核酸内切酶切割序列相似但不相同的识别位点。如果酶不能完全被切掉,我该怎么办?2)模板性质是否清楚:切割效应与DNA性质(线性、超螺旋)、位点数量、位点周围的序列、甲基化程度、纯度等有很大关系。超螺旋脱氧核糖核酸完全酶消化所需的酶量是线性脱氧核糖核酸的几倍。3)模板的纯度是否足够。4)甲基化程度是否影响酶的活性。5)反应条件是否合适:温度、牛血清白蛋白、缓冲液、DTT6)酶稀释和添加的方法是否正确。一般来说,酶是在最后加入的,预先混合,作用更快。分装前没有混合。需要把它放在冰里,尽快使用。其他结果:限制性内切酶切割后的部分电泳条带随蛋白质扩散,DNA结合酶切割条件不合适,星号活性被核酸外切酶污染。如果通过限制性内切酶切割DNA获得的片段除了预期的多种限制性内切酶的星号活性之外,还存在其他限制性内切酶污染,并且在测试DNA中发现其他的限制性内切酶污染,则连接样品的DNA片段的预期电泳结果,1:DNA/ECO 14酶片段2-3:DNA/ECO 14酶片段的连接产物,连接注意事项,反应液:三磷酸腺苷和二氧化镁,无高盐或乙二胺四乙酸,在环磷酸,磷酸腺苷或汁液完全失活,脱氧核糖核酸酶的量和反应时间根据生产者的定义确定,通常为160过夜或250/1h。1。连接缓冲剂的作用:通常,缓冲剂包含以下组分:20-100摩尔/升三盐酸,大于50摩尔/升,酸碱度在7.4-7.8范围内,大于7.8,以提供具有合适酸碱度的连接系统;用10摩尔/升氯化镁活化酶反应;1-20毫摩尔/升,大部分为10毫摩尔/升,用于维持还原环境和稳定酶活性,25-50微克/毫升的牛血清白蛋白用于增加蛋白质浓度和防止因蛋白质浓度太低而导致的酶失活。与限制性酶缓冲液不同,连接

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