《遗传信息传递》PPT课件.ppt

第七章遗传信息的传递,复制、转录、翻译,DNA,RNA,蛋白质,复制,转录,反转录,翻译,遗传信息传递的中心法则Centraldogma,遗传信息传递的中心法则概述,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,遗传信息传递的中心法则,第一部分DNA的生物合成第二部分RNA的生物合成第三部分蛋白质的生物合成,DNA为遗传信息的储存者RNA为遗传信息的传递者蛋白质为遗传信息的体现者,原核生物每个细胞中只含有一个染色体，真核生物每个细胞含有多个染色体。染色体DNA的复制与细胞分裂在密切的相互联系。一旦复制完成，就可发动细胞分裂，细胞分裂结束后又可开始新的一轮DNA复制。细胞内存在极为复杂的系统，以确保DNA复制的正确性，并纠正可能出现的误差。,第一部分DNA的生物合成,1DNA的半保留复制2DNA复制的起点和方向3原核细胞的DNA复制4真核细胞的DNA复制5反转录作用6损伤和修复7细菌的限制和修饰系统8基因重组和克隆9聚合酶链式反应技术与DNA扩增,DNA的每一条链都含有合成它的互补链所必需的全部遗传信息。DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。,1.1DNA的半保留复制的概念,由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconservationreplication)。,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中,子代DNA,如何证明？,全保留式,复制可能的几种方式,半保留式,混合式,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。,该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。,MatthewS.Meselson,FranklinWilliamStahl,1.2半保留复制的实验证据,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。,1.3半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,复制起始点：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点。复制子(Replicon)基因组能独立进行复制的单位称为复制子，每个复制子都含有一个复制起点。它是复制的功能单位。,2DNA复制的起点和方向,2.1概述,在复制的起始点处，DNA双链部分解开为单链，形成叉子形状称复制叉（replicationfork）。,2.2DNA复制的起点和方向的类型1)两个起点，两个生长端的相向复制DNA每条链有1个复制起点，分别合成1条新DNA，两条新链相向合成，每个生长点只有1条链合成，这种方式存在于线性DNA病毒。2)1个起点，1个复制区的单向复制DNA两条链的复制起始点在同一位置，复制向一个方向运动，两条DNA链均被复制，这种方式偶见于一些环形DNA的复制。3)1个起点，两个复制区的双向复制这种DNA复制方式最为普遍，复制起始于1个位点，形成两个复制区向相反方向运动，在每个复制区两条DNA链均被复制。,DNA复制的起点和方向示意图,原核细胞DNA复制只有一个复制起始区，因此它只有一个复制子。通常细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的。真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。,E.ColiDNA复制起点的genemapping,E.Coli染色体DNA复制:复制时有一个复制起点，双向展开，形成状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复制称复制。,亲代双链（或单链）DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5端游离出来。DNA聚合酶便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3-OH端。当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为5端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3-OH端（+）为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链（-）为模板向前延伸，因而称为滚环(Rollingcircle)复制。,噬菌体,双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到呈D环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明复制起点是以一条链为摸板起始合成DNA的一段序列；两条链的起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生D环（D-loop）复制。,线粒体,3原核细胞的DNA复制,3.1具备的基本条件3.2参与DNA复制的酶及蛋白质3.3岡崎片段和半不连续复制3.4原核生物双链DNA复制过程,3.1必须具备的基本条件,模板：解开成单链的DNA母链原料：底物为dNTP(包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合酶:依赖DNA的DNA聚合酶，引物：一小段RNA,提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子,3.2.1DNA聚合酶(DNAPolymerase),共同性质1以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA2需要模板和引物的存在;3不能起始合成新的DNA链;4催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端;5催化DNA合成的方向是53。,3.2参与DNA复制的酶及蛋白质,DNA聚合酶的全称：依赖于DNA的DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶,E.coliHasatLeastFiveDNAPolymerases分别为DNA聚合酶I、II、III、IV、V。,1956年Kornberg等在E.coli中发现的第一个DNA聚合酶，是DNA复制研究中的重要里程碑，因此于1959年获得诺贝尔化学奖。,a)DNApolymeraseI（polI）：,相对分子量为10300，由一条多肽链组成，含有一个锌原子，每个大肠杆菌细胞约含有400个DNApolymeraseI。,功能（1）53聚合作用（2）35核酸外切酶的活性（3）53核酸外切酶的活性（4）焦磷酸解作用（5）焦磷酸基交换的作用因此它属于一种多功能酶,用胰蛋白酶或其他蛋白水解酶处理DNApolI可以得到两个片段。,大片段：具有聚合酶的活性和35核酸外切酶的活性，称Klenowfragment。是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,小片段：具有53核酸外切酶的活性。,DNApolI,RNA引物,模板链,1）53聚合作用,在引物RNA3-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。,5至3的聚合活性，催化的反应：,dTTP,3,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+ppi,DNApolI53聚合作用示意图,DNApolI不能“从无到有”，只能从已有的多核苷酸链的3-OH端延长DNA链，也就是说必须要有Primer,Primer必须要有一个游离的3-OH。新链的延长只可沿53方向进行。,Primer,-OH,酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3-OH与5-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。,2）35外切酶活性校对作用这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。对于DNA复制的忠实性极为重要，但对双链不起作用。,3）53外切酶活性切除修复作用从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。,35外切酶活性,53外切酶活性,?,能切除突变的DNA片段,能辨认错配的碱基对，并将其水解,核酸外切酶活性,Pol是由一条分子量为88Kd的多肽链组成，它的活性大约只有pol活性的5%，也要模板和带3-OH的引物，最好的模板是带短的缺口的双链DNA，有53聚合酶和35核酸外切酶的活性，但没有53核酸外切酶的活性，主要用于DNA的修复。,b)DNAPolymeraseII（DNApolII）：,1970年和1971年先后分离出polII和pol，,是由多种蛋白质组成的复合物，每个E.coli约含10分子DNApol，但活性很强，为pol的15倍，模板和pol大致相同，除聚合酶活性外，还具有35核酸外切酶的活性，但无53核酸外切酶的活性，DNApol是原核细胞DNA复制的主要酶。这个酶的缺陷株往往是致死的。,c)DNApolymerase(DNApol)：,pol由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，与DNA复制的校正功能有关。,大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较,1999年发现DNApolymeraseIV和V，它们涉及DNA的错误倾向修复,复制时必需解链，如靠旋转，则大肠杆菌DNA要达到每分钟6000转。DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。复制时是用解螺旋酶和拓扑异构酶来解链的。,3.2.2解链酶(又称解螺旋酶,helicase),利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。,3.2.2解链酶(又称解螺旋酶,helicase),作用：断裂互补碱基间的氢键,使DNA双链分离形成“复制叉”。,拓扑异构酶作用特点：既能水解、又能连接磷酸二酯键,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。,3.2.3拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）,DNA拓扑异构酶的作用机制,3.2.4单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）,螺旋酶沿复制叉方向解开的单链DNA，会很快与单链DNA结合蛋白结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。SSB结合到单链DNA上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNA作为模板。SSB可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSB便会脱落，并被重复利用。,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。,3.2.5DNA连接酶(DNAligase),功能DNA连接酶在复制中起最后接合切口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,切口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,3.2.6引物酶(Primase),DNA不能从无有合成，需在一小段RNA引物基础上合成DNA。RNA引物的合成需引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶，可合成6-10个碱基的RNA引物。,酶或蛋白质主要作用DNA聚合酶水解引物、填补空隙、修复作用DNA聚合酶DNA复制解链酶类解开DNA双链单链DNA结合蛋白维持已解开单链DNA的稳定拓扑异构酶类克服解链时打结及缠绕、松驰或引进负超螺旋DNA连接酶催化双链DNA中单链切口的连接引物酶合成RNA引物,参与DNA复制的酶及蛋白质,DNA分子的两条链是反向平行的3-5和5-3，但是复制的方向只能是5-3,？,不连续的滞后链的片段叫作冈崎片段（Okazakifragment）,3.3岡崎片段和半不连续复制,在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可连续复制，称为前导链（leadingstrand）；,而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段合成，称为滞后链（laggingstrand),复制的半不连续性,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,5,3,5,解链方向,冈崎片段（Okazakifragment）,3,5,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,3.4.1复制的起始,3.4原核生物双链DNA复制过程,DNA复制的起始阶段，由下列两步构成：1解旋解链，形成复制叉DnaA蛋白辨认起始点，由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉（replicationfork）。,2引发体组装和引物合成在E.coli中，由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白(协助DnaB)、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体(primosome)；在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,引发体的组装,DnaA,DnaB、DnaC,DNA拓扑异构酶,SSB,3,5,3,5,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH3,3,DNA复制的延长过程,复制起点解开后形成2个复制叉，进行双向复制，前导链和滞后链的合成都需要RNA引物，前导链先由引发酶在起点处合成一段RNA引物，随后DNApolIII即在引物上加脱氧核苷酸。前导链的合成与复制叉的移动保持同步。,a)前导链的合成,3.4.2DNA的延伸,后随链的合成是分段进行的，需要不断合成冈崎片段的RNA引物，然后由DNApolIII加入脱氧核苷酸。,b)滞后链的合成,滞后链的合成比较复杂，由于DNA的两条互补链方向相反，为使滞后链能与前导链被同一个DNApolIII不对称二聚体所合成，后随链必须绕成一个环状（loop）。,DNA聚合酶催化先导链和随从链同时合成,复制过程简图,3.4.3复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,（1）去除引物，填补缺口：,（2）连接冈崎片段：,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,随从链上不连续性片段的连接,解旋：由拓扑异构酶解除DNA的超螺旋结构。解链：由解链酶使双链DNA解开再由单链结合蛋白与单链结合，防止氢键再形成。识别起点：由DNA指导的RNA聚合酶即引物酶完成。生成引物：以DNA为模板在引物酶催化下由DNA转录成。DNA的生成：在RNA引物3末端上按碱基互补原则经DNA聚合酶III催化生成，其3末端与下一个RNA引物5末端相连。,3.4.4DNA合成步骤总结,切除引物：由DNA聚合酶I催化切除引物补齐封口：DNA聚合酶I利用其DNA聚合酶活性按碱基互补原则沿5-3方向填补两个冈崎片段之间的缺口。其3末端羟基与下一个DNA片段5末端相连磷酸基，在DNA连结酶催化下形成磷酸二酯键而被连结起来，最终形成DNA模板链的完整新的互补链，此部由NAD+供能。,G1,G2,S,M,哺乳动物的细胞周期,DNA合成(synthesis)期,4真核细胞DNA的复制,细胞能否分裂，取决于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,4.1真核细胞DNA多个起点复制,4.2真核细胞中DNA聚合酶的性质,4.3真核生物的复制终止,1，染色体DNA呈线状，复制在末端停止,2，连接不连续片段,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,4.4端粒,以表彰他们“发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的”。,伊丽莎白布莱克本,卡萝尔格雷德,杰克绍斯塔克,2009年诺贝尔生理学或医学奖,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。,端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶的分子结构,端粒酶的爬行模型（动画演示）,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,真核和原核DNA细胞复制比较,5反转录(reversetranscription),反转录:以RNA为模板，dNTP为原料，反转录酶催化，按碱基配对规律合成DNA的过程。,DNA,RNA,RNA(病毒),5.1概念,逆转录酶三种功能,5.2逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶)RNA-dependentDNApolymerase,RDDP,逆转录过程中cDNA的合成,RDDP催化反应示意图,反应时模板与引物以氢键相连，在引物3羟基末端开始以5-3方向进行DNA的聚合、延伸。合成的DNA以共价键相连，形成DNA-RNA杂合体。在DNA指导的DNA聚合酶催化下以杂合体中的DNA为模板合成一条DNA互补链，形成新的DNA分子。,5.3逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现，扩充了中心法则。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能，与真核细胞分裂和胚胎发育有关。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。逆转录酶是分子生物学重要工具酶。,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变mutation）从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤（DNAdamage）,6.1DNA的损伤和修复,6.1.1突变的意义,6.1.2引发突变的因素,由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,(1)物理因素,(2)化学因素,6.1.3突变的类型,(1)点突变（pointmutation）,指DNA分子上一个碱基的变异,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,转换,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,颠换,(2)缺失（deletion）、插入(insertion),缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间,插入和缺失引起的突变称为框移突变(frame-shiftmutation),(3)重排（rearrangement）,DNA分子内发生较大片断的交换，也称为重组,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,6.1.4DNA损伤的修复(repair),是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。,光修复(lightrepair)切除修复(excisionrepair)重组修复(recombinationrepair)SOS修复,修复的主要类型：,这是一种广泛存在的修复作用，但哺乳动物细胞缺乏，能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。修复过程由光修复酶(photolyase)催化完成。,(1)光修复（lightrepair）,光修复酶的分子结构,其修复过程为：光修复酶(photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。在300600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开。光修复酶从DNA上解离。,是修复DNA损伤最为普遍的方式，可适用于多种DNA损伤的修复。对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。,(2)切除修复(excisionrepair),这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。先复制后修复修复时，利用重组蛋白RecA的核酸酶活性，将另一股健康亲链与损伤缺口相互交换。,(3)重组修复(recombinationrepair),RecA的分子结构,RecA重组蛋白修复DNA示意图,又称复制后修复。受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。重组修复中原损伤没有除去，但若干代后可逐渐稀释，消除其影响。,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli中，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,(4)SOS修复（SOSRepair）,第二部分RNA的生物合成,在生物界中，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式，也是本章介绍的主要内容。另一种是RNA指导的RNA合成（RNA-dependentRNAsynthesis），也叫RNA复制（RNAreplication），由RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase）催化，常见于病毒（如SARS），是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。,在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录（transcription）。,转录的概念,复制和转录的区别,1DNA指导的RNA合成转录,1.1参与转录的物质1.2RNA聚合酶和转录的模板1.3原核生物的转录过程1.4真核细胞的转录作用1.5转录过程中的选择性抑制1.6转录产物的加工,1.1参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA-pol)其他蛋白质因子,RNA聚合酶能直接启动RNA链的合成DNA依赖的RNA聚合酶催化合成RNARNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相类似。,1.2.1依赖DNA的RNA聚合酶,(DNA-dependentRNApolymerase,DDRP),(NMP)n+NTP(NMP)n+1+ppi,RNA,延长的RNA,E.Coli中的RNA聚合酶由5种亚基2组成全酶（holoenzyme）。其中亚基可以受到利福平或利福霉素抑制。,1.2.2E.coliRNA聚合酶各亚基的大小与功能,没有亚基的酶称为核心酶（coreenzyme），只催化链的延长；加入亚基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，亚基称为起始因子。,核心酶,试管内的核心酶能催化RNA的合成试管内含有模板（DNA）、核心酶、底物（NTP）但是没有固定的起始点，也不能区分双链DNA的模板链和编码链活的细胞转录起始需要全酶，但转录进行到延长阶段，则仅需要核心酶。,亚基,能识别模板上的信息链和启动子，保证转录能从固定的正确位置开始。在转录延长时（首个磷酸二酯键形成后）脱落，可以反复使用，所以与转录延长无关。,1.2.3RNA聚合酶催化的反应,A,C,G,A,C,G,U,U,模板DNA,5,3,新合成RNA,不需引物，催化形成第一个3,5-磷酸二酯键，沿53方向延伸RNA链。底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）；没有校正功能,能够转录RNA的那条DNA链称为模板链(templatestrand)，也称作有义链或Watson链。与模板链互补的另一条DNA链称为编码链(codingstrand)，也称为反义链或Crick链。,1.2.4转录的模板,模板链、编码链与转录及翻译的关系,1.2.5不对称转录,DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录。不对称转录的两方面含义：DNA分子上的一条链可转录，另一条不转录；不同的基因，模板链并非永远在同一单链上。由于基因分布于不同的DNA单链中，即某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。细胞内DNA不是其全长都可作为转录模板。,模板链,编码链,1.3原核生物的转录过程,RNA链的转录，起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因（真核），也可以是多个基因（原核）。基因的转录是有选择性的，细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变，将转录不同的基因。转录的起始由DNA上的启动子区控制，转录的终止由DNA上的终止子控制，转录是通过DNA指导的RNA聚合酶来实现的。,1.3.1转录起始,转录起始需解决两个问题：1)RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。2)DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,（1）启动子（promoter）的概念：RNA聚合酶与模板DNA结合的特定部位，是基因转录的开始部位。原核生物启动子的3个功能部位：转录起始点,常标以+1,第1个核苷酸为嘌呤核苷酸(A或G)，上游或下游,+或-表示。结合部位,长度为7bp,-10区,有一共有序列(-TATAATPu-,又称Pribnowbox)。RNA聚合酶的识别部位,由约6bp,-35区。,原核生物启动子的保守序列,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2、DNA局部双链解开，形成开放转录复合体。,1、RNA聚合酶全酶(2)辨认并结合于启动子部位，形成闭合转录复合体。,3、在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi,（2）转录的起始过程：,E.Coli的转录和延长,1.3.2转录延长,a)亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；b)核心酶沿模板链35方向移动，在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链按碱基配对规律沿53方向延伸c)“转录泡”和DDRP不断移动(单链模板不断暴露)，转录连续不断地进行。d)新生链与模板链形成杂化双链，该杂化分子结构不稳定，RNA链游离后，DNA双链重新形成。,原核生物转录过程中的羽毛状现象,同一DNA模板多个转录同时进行。转录未完成，翻译已进行。,当核心酶沿模板35方向移动到终止信号区域时，转录就终止。提供终止信号的DNA序列称终止子。,1.3.3链的终止：,a）依赖Rho因子的转录终止由终止因子（因子）识别特异的终止信号，并促使RNA的释放。,RNA转录合成的终止机制有两种：,b）非依赖Rho的转录终止,a)非依赖Rho因子的转录终止（强终止子）,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的发夹形二级结构来终止转录。,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,转录终止的机理,不依赖于因子的终止：这类终止子结构上有2个特征,（1）DNA链的3端附近有回文结构，富含G-C碱基，转录而形成的RNA具有茎环的发夹形结构（hairpinstructure）（2）发夹结构末端紧跟6个连续的U,b)依赖的终止子（弱终止子）,必需在因子帮助下，识别DNA链上的终止信号，才发生终止作用。因子功能：(1)能帮助DDRP识别终止信号并停止转录(2)具有ATP酶和解链酶活性，使RNA-DNA杂化分子解链，从而释放转录产物RNA分子,原核生物中的终止因子蛋白是一种六聚体的蛋白质，亚基的分子量为50kd。蛋白能识别转录终止信号，并与RNA紧密结合，导致RNA的释放。,蛋白,ATP,依赖Rho因子的转录终止,1.3.4RNA转录过程总结,RNA转录由起始、延伸、终止三个阶段组成。起始：RNA聚合酶在亚基的引导下结合于启动子；DNA双链局部解开；在模板链上通过碱基配对合成最初RNA链。延伸：核心酶沿着DNA链由35的方向移动，RNA链按碱基配对规律沿53方向延伸。转录区间的DNA双链解螺旋，而转录完的区间DNA又恢复双螺旋结构。终止：核心酶到达终止子，RNA与核心酶从DNA上脱落。,相同：要有模板，需要解链，新链延伸方向53，碱基的加入严格遵循碱基配对原则。相异：复制需要引物，转录不需引物。不对称转录，转录只涉及DNA分子受限的部分片断。复制是半不连续的，转录是连续的。聚合酶不同:DNA聚合酶；RNA聚合酶转录时，RNA聚合酶只有53聚合作用，无外切酶活性。RNA聚合酶无校对功能。原料不同:dNTP；NTP碱基配对不同:dA-dT；dA-U产物不同:子代双链DNA；mRNA,rRNA,tRNA,1.3.5转录与DNA复制的异同：,真核细胞RNApol种类较多，根据它们对-鹅膏蕈碱的敏感性不同分为RNApolI、II、III，它们是高度分工的，不同的RNA聚合酶负责合成不同的RNA。,1.4真核细胞的转录作用,1.4.1真核生物的RNA聚合酶,不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA序列，但这些序列都统称为顺式作用元件（cis-actingelement）。,1.4.2转录起始需要启动子、RNA聚合酶和转录因子的参与,（1）转录起始前的上游区段具有启动子核心序列,典型的真核生物基因上游序列,顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件等近端调控元件和增强子等远端序列。起始点上游多数有共同的TATA序列，称为TATA盒（TATAbox）。通常认为这就是启动子的核心序列。,TATA,-30,5,3,+1,转录起始子,TATA盒,调控序列,许多RNA聚合酶识别的启动子具有保守的共有序列：位于转录起始点附近的起始子（initiator，Inr）。启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列，多在转录起始点-40-100nt的位置，比较常见的是GC盒和CAAT盒。增强子是能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,真核生物RNA聚合酶转录的基因及其转录起始上游序列,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，统称为反式作用因子（trans-actingfactors）。现已发现数百种。反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子（transcriptionalfactor，TF）。,（2）转录因子,参与RNA-pol转录的TF,真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,iPS细胞（inducedpluripotentstemcell）,4种干细胞转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc,2006年日本ShinyaYamanaka在Cell上首次报道了诱导多能干细胞iPS,韩国首尔大学调查委员会公布的最后调查结果。证实黄禹锡及其研究小组除成功培育出全球首条克隆狗外，其余科研成果均系造假。伪造包括：2004年论文中所提到的通过人类体细胞克隆早期胚胎而提取的干细胞根本不存在。2005年发表在Science杂志上的论文完全属于造假，将两个干细胞系夸大为11个干细胞系，并且这两个胚胎干细胞也并非体细胞克隆干细胞，而是受精卵胚胎干细胞。,1.5转录过程中的选择性抑制,原核生物RNA聚合酶可以被利福平抑制，对革兰阳性球菌及结核杆菌有很强的抗菌作用。真核生物RNA聚合酶根据它们对-鹅膏蕈碱（-amanitin）的敏感性RNA聚合酶II。,鬼笔鹅膏,1.6转录产物的加工,各种RNA合成时，先以DNA为模板生成分子量较大的RNA前体(初级转录产物)，然后在专一酶的作用下切除多余的部分，或进行修饰，最后生成有活性的成熟RNA，此过程称RNA转录后的加工。,几种主要的加工方式,1.剪接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),不论原核或真核生物的rRNAs和tRNAs都需要转录后的加