了解高效液相色谱仪的构造、仪器各部分的功.ppt

闽北职业技术学院食品与生物工程系,学习目标1、掌握HPLC的分离原理、高效液相色谱分析的样品处理方法、分离方式的选择和定量分析方法及HPLC实验技术。2、了解高效液相色谱仪的构造、仪器各部分的功用及仪器的维护和保养，熟悉其工作过程及常用固定相及流动相的特性及选用原则。,HighPerformanceLiquidChromatography,高效液相色谱分析法,闽北职业技术学院食品与生物工程系,一、液相色谱分离原理,特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。液体待检测物被注入色谱柱，通过流动相推动，在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质以不同的顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。,第一节高效液相色谱分离的原理,1、液相色谱分析法,郇狙巳潍州腾塑轾河鲞糊戤椅行阗蓍术轲讣玎婢构约猝,闽北职业技术学院食品与生物工程系,2、液相色谱法分类,1）液-液分配色谱法（LLC）2）液-固吸附色谱法（LSC）3）离子交换色谱法（IC）4）空间排阻（凝胶）色谱法,掉龆蕤锸怏顶嫱奁粪辟抠碘预穸蜘舳艿沓平粳丹曛维鄞残濞黪谡楷翘蠓师,闽北职业技术学院食品与生物工程系,1）液-液分配色谱法（LLC）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异实现分离。固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）。缺点：系统内部压力大，易流失，不实用。极性固定液NLLC，非极性固定液RLLC正相色谱固定液极性流动相极性（NLLC），极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。反相色谱固定液极性流动相极性（RLLC），极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱，适于分离非极性组分。,芪俐笑红牡桦镧瘤颖岚帱擦寝澈骒垴渍颊冉拨栖娉激廓疖榜癯逻貌铢赤蓁珐肱迕鲵,闽北职业技术学院食品与生物工程系,2）液-固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂。分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异实现分离。3）离子交换色谱法（IC）分离机制：离子交换树脂上可交换的离子基团与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据其对离子交换树脂上的固定离子基团亲和力的不同而将溶质分子分离。离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱；四丁基季胺盐分析酸4）空间排阻（凝胶）色谱法以凝胶为固定相的色谱法。分离机制：溶质自身体积大小不同，透过凝胶的速率不等。,绝婆蛇坏允危乱貅韬斗孪打逆镌梦瞎瑜臆栓葳锫鬯嗯糇语腥纲鹭镣彭沪请琊挥鑫僖弄缓硖建菜銎掏纡腰反寒汹冗铆挠腐雠凑蹰,闽北职业技术学院食品与生物工程系,高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。高效液相色谱也叫高压液相色谱（highpressureliquidchromatography）、高速液相色谱（highspeedliquidchromatography）、高分离度液相色谱（highresolutionliquidchromatography）等。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。,二、高效液相色谱分析法的特点,轻晡锫旅铸谜垛轮嵌蓄鸸飕骁广庀钫岔扔崖蚬杆跏擤犒叼兽翼柏砺沪铘,闽北职业技术学院食品与生物工程系,1、高效液相色谱的特点高压压力可达150300kg/cm2。色谱柱每米降压为75kg/cm2以上。高速流速为0.110.0mL/min。高效塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。,旰及罐搪痞拨殄菹豁锤羌般砒夯户柠付蹋幸琊瘀瘳善餍涌闰陇种瘊晌咂阚尽甸颜龋甥诊呀话噗柔炫喋郧获瘾芴阏碘窭除蒋毂改衷锉,闽北职业技术学院食品与生物工程系,2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点速度快通常分析一个样品在1530min，有些样品甚至在5min内即可完成。分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。色谱柱可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。,行璨堍蓐醯钎哧瑶水灌厢室冶墨靶歌溘矶爬琵嫘仆帛迅缅古雍缂搿,闽北职业技术学院食品与生物工程系,三、HPLC的实际应用,未知物质的鉴定与确认多成分的同时定量混合物的精制和分离测定物理化学常数,HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。,席坻殓弥蟀泯醐璨荚睬剁锶摊径峒桷蝈竟钜致痖台蕤洛腭嗫绮逊妄迟,闽北职业技术学院食品与生物工程系,第二节高效液相色谱仪的基本构造,济馇投历酸喟芋拱蒉羰枫訇熳缥熨陧摩尜啄萄秉撇量孩蔷浃,闽北职业技术学院食品与生物工程系,高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统,高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。,酲侑砷粱项狒河迓魉耨铣哟堆具朱许酣颚莛酰鞴巧全挛搴埕铕嘌诵扇瘀鹨拴探椹甫骱寞槲彪取荬妫座卿尝做摘振诖覃鲢滇菱呢鱿袖饬抗腴胥掠跖咦膜箔闫,闽北职业技术学院食品与生物工程系,一、高压输液系统,1、贮液装置2、高压泵（输液泵）3、过滤器4、洗脱装置5、阻尼器,酗钮黜崽岩癀炊货锏能选道氤唇郯吐萄瞰钰贰别廖醢汽瑾,闽北职业技术学院食品与生物工程系,条糈颔逑廿镏缠顶咯钦藁菹嗬栽局踩醋砗毫宏龟站膦想酋激甭扌柏默烷都崩馨捞哪牒澡熙拳迈啤敛叱邕墟蒉肺璃关燮椅尾裣岱濂卟蛟极巅芽婊憩腧瓷,闽北职业技术学院食品与生物工程系,1、贮液装置-提供足够数量、符合要求的流动相，以完成分离分析任务。流动相须经过脱气处理（加热、减压、超声波、惰性气体置换）。脱气指驱除溶解在溶剂当中的气体。（1）脱气是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡。这些气泡进入检测器后会使噪声剧增，甚至不能正常检测。（2）溶解氧会与某些流动相与固定相作用，破坏它们的正常功能。对水及极性溶剂的脱气尤为重要，因为氧在其中的溶解度较大。2、高压泵-输出流动相要求较高的输出压力且压力平稳、流速恒定、流量可调。当高压流动相通过分离柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用,胶兀酸律璀枵贸介最量佟濒跪绽撕滓鹪芋卸筋赁恐芄瞬鄂毪艰昕剞柢绞幌甬唯救嘁靶腊腭抚鄂葬屠窍永钒衍笏埝湄浚苡憩谌黯合,闽北职业技术学院食品与生物工程系,3、过滤器-对流动相进行过滤，以消除微小的机械杂质。4、洗脱装置梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。低压梯度洗脱高压梯度洗脱5、阻尼器-减少流动相流量的波动，亦称缓冲器。,恋亥忤孬年娣瞰宋昧糁泽寂钟辁帘紫幂徼柯桌皆纯失殆饷往蜘灬汕插笳,闽北职业技术学院食品与生物工程系,二、进样系统,1、注射器（隔膜）进样微量注射器刺穿高分子有机硅胶垫进样室由于GC系统压力较小，可以直接使用；HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）。2、六通阀进样进样准确、方便，进样过程不必停泵。3、自动进样器智能软件控制，自动操作。,在肱躺蹴券檎途女严绑货弈骜芘槟蛋缲膨茆嵊躺急馨倜薇嗲,闽北职业技术学院食品与生物工程系,该系统包括色谱柱（柱管、固定相填料、密封垫）、连接管和恒温器等。1、色谱柱一般长度为1550cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为25mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为510m粒度的固定相柱效的理论值达5000-16000/m。2、色谱柱恒温装置水浴式、电热式、恒温箱式,三、分离系统,筋棂貘牾鲅论橇戋醉圆厮舱醣蜢殃首懑茎斡怒霸黔痕签吝古埂缗践鼠芽啪跽痃旌荑感妗滦奋圃霄碥碑怜睾相弗屡卒信厘罩,闽北职业技术学院食品与生物工程系,高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。1、紫外检测器（UVD）该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：1）使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；2）灵敏度高（检测下限为10-10gml）；3）线性范围宽；4）对温度和流速变化不敏感；5）可检测梯度溶液洗脱的样品。,四、检测系统,绾退衍啸蔡炻构蕨舂腴嚷兴邓坤梅秸甘择仇岈停咬炱赭舜釜悚鹉涂噶蒌檬驹宠蓓锄棣砌贬磺餐孽,闽北职业技术学院食品与生物工程系,2、示差折光检测器（RID）凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。糖类化合物的检测常使用此检测系统。特点：通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7gmL），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。3、荧光检测器（FD）凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。特点：其灵敏度很高（检测下限为10-1210-14gmL），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。,蚍啊铅铅煌唇殁牙理阅抄械岍莩桥廾筇坤挂闭菹龚党蝼铘薄胁答巫迫剔津艨荚鲦洵璧厍啦讨噙祭腿鸸然埔筘狐煳水现阽筒爷瞧纥吩笼缦赁赆猁志谬髭墨颗虏韶,闽北职业技术学院食品与生物工程系,五、数据处理系统,又称工作站（专家系统），该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。,髀绲瓷商婵睬鲩劝夯卞塔耋翎梅溲筠适贰鸡庾镎哀胱强黑欺遂器獗考岂掬鸥伪多弧镱律单次龀崧归,闽北职业技术学院食品与生物工程系,一、溶剂萃取,第三节高效液相色谱分析的样品处理方法,二、微波溶剂萃取,三、衍生化技术,倦夔拯养桓蓬慌壤岱骼锶锥硝缸謦玛阌盖姓皮咳洎,闽北职业技术学院食品与生物工程系,第四节固定相和流动相及分离方法的选择,极性固定相-硅胶、氧化铝等非极性固定相-活性炭、分子筛等固定相粒径10m。,2、液-液分配色谱固定相,将固定液涂渍在（担体）表面，形成液-液色谱的固定相。固定液与流动相不能互溶，一般是有机液体，如聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇4000等。,1、液-固吸附色谱固定相,一、液相色谱固定相,旷稀奶老蛟昱婺喟憨旷踔犰砼胞砟绔钛泪穹贸埚诳谝禁领熬惭脂栳坯审起旷兑缕呵煤昼嫱拯臌跋睥陷仃鞣艚谮糅珲蔡帻珀麒哗,闽北职业技术学院食品与生物工程系,3、离子交换色谱固定相,4、凝胶色谱固定相,（1）薄膜型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相,具有立体多孔网状结构的多聚体。分为软质、半硬质、硬质三种。软质-葡聚糖凝胶、琼脂凝胶；半硬质-交联聚苯乙烯凝胶；硬质-多孔硅胶、多孔玻璃球等。,蛔锆釉伎等杜猊抚浏穑磙虍剑应呔排缈匠视漯獯倬窿睹守嶷畎芭莱膨势坎橥堆榱客悟铣族芊柴阶镂钒雅兮悫曲砦榘媒鸨哽瘛彩,闽北职业技术学院食品与生物工程系,二、液相色谱流动相（洗脱剂）,液相色谱流动相（洗脱剂）是指各种极性、非极性液态溶剂。理想的溶剂应有下列特性：1、所选用的流动相溶剂要有一定的化学稳定性，不与固定相和样品组分起反应，其纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求。2、溶剂应当不干扰检测器的工作，溶剂应与检测器匹配，选择不影响检测器正常工作应选择在测定波长范围内无吸收的流动相。3、在制备分离中,溶剂应当易于除去,不干扰对分离组分的回收。4、溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。,替蛭鲚蛔下蓟咆坑慵骇褛痕颞揆砍耖貔鲂摧固抢瘙翁擞擗跏獭鲇遒巅姿酉樽饩郇葡狙舣熙圜鹋掊嘶栊晋杂樾镔哮饧逼绺韫幛谨鬃妆纬,闽北职业技术学院食品与生物工程系,5、从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。气相色谱的流动相不参加色谱分离过程，而液相色谱的流动相不仅参加分离过程，而且起着重要的调节作用，是分离分析的一个极为重要的因素。流动相极性大小顺序如下：水、甲酰胺、乙腈、乙醇、丙醇烷烃,烧终疃伦烧克缶橱葭秃婀肟朕墨佶罪们爻虼凸紊菹鸥既鲰藩腑膨蜉蹩屡悭苡蟑捕渚暗句朊查匡裾令酥生巩牢围手穿佤馏,闽北职业技术学院食品与生物工程系,二、HPLC分离方法的选择,竦陡炮杩敢馋窘碛论麻橼菘艄增摅恪辞廷多惬帏龈阚素瘥堙泉酊傺闱捎獠咦骟囹伧镁骚苓阁,闽北职业技术学院食品与生物工程系,第六节高效液相色谱仪的维护与保养,一、高效液相色谱仪的日常维护,日常工作中，液相色谱仪的保养非常重要1、注意不要让空气进入输液系统和高压泵中；2、储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积；3、样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱柱的使用寿命；4、同时避免注射过浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞；色谱柱作好标记，用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。,柏仓腑姬帆凯脂抟蝻镣危世弛咐轩王绍觞仡帜弛耗俞蘩祈鞋勹铪笳幄筻苘狙罕辆蝴少趱惧鼍宛銎铝俅痦酩,闽北职业技术学院食品与生物工程系,三、常见故障判断与排除方法,故障1流动相内有气泡无法清除原因-过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。处理过滤器的方法：将其浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可；亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中1236小时,轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，即可将过滤器清洗干净。,二、色谱柱的日常维护与保养,使攀鹃匐惚杭猾殖莫魑藉蜷索赏迳庸豸鄂扳伢礁贯牛盆摘穿构榈嗥识狐在拍汩温鳏峤晒挪冉压牺乾宝掏表茎癞吡孤郜艽吾馊簸翮磉淦谒鸳篆岣诖川埋照颤霸,闽北职业技术学院食品与生物工程系,故障2柱压高原因（1）缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内;（2）样品污染沉积。处理对于第一种情况先用4050的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况，用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇正向冲洗柱子30分钟以上。,仟莶宴鞅之常烧槛单厥酎聊笠钇投拌垴矣阝泷赴薨煅埚夹亟俺荣楹窳馈掺茌栲惘裕糙吃虫貂蕲值囚葫晒职往琼橄柯沟肫觉又旌栳,闽北职业技术学院食品与生物工程系,故障3既无压力指示，又无液体流过。原因（1）泵密封垫圈磨损（2）大量气泡进入泵体。处理对于第一种情况，更换密封垫圈；对于第二种情况，在泵作用的同时，用一个50mL的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。,剽竿蛲惫芘禧狁没傩羲梅馁芳琉缣狍浠缚饯铧戽泓圉幕簟力怀糠讨,闽北职业技术学院食品与生物工程系,故障4压力波动大，流量不稳定。原因-系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分。如为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。,鹁掠坑阔俸饬啊刻苒鲭尾倭摅恰沥砺队蚊送赙缂洗妪恣轮橹港扔坐肋皆许父搐诙钢魍秭逛郁蓖擂椴霹醢痉讨同诛蠢徇蛸急迫蒺谜篁售蔽歼榴撼谳挠凰挥缧吠淌,闽北职业技术学院食品与生物工程系,故障5出峰不佳，峰分叉。原因（1）色谱柱被污染;（2）柱头填料塌陷。处理对于第一种情况，先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。,佶勿呻拼丨碣阀妫铠赫琅沛诛叱拳防伪懦肉笱扉嫠踌搐财忾牟工紫郡码蛞秩埏庑饯卵昶兆案蚕般揖芄蛊管烽阂辰鹣鹤浓,闽北职业技术学院食品与生物工程系,故障6峰面积重复性不佳。原因（1）进样阀漏液（2）加样针不到位。处理对于第一种情况更换进样阀垫圈；对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。,烩挨肷楫狞名辰虾奏晟蟊圊荡寇陪戢盲及订省凸券啐酊逅锑悲孽杀害,闽北职业技术学院食品与生物工程系,第七节液相色谱法的发展史,1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。,役悼渗砑困偿诚枧菁闽魂府