细胞生物学研究方法PPT课件

,医学细胞生物学（第5版）第三章细胞生物学的研究方法,2,上次课第一节显微镜技术第二节细胞的分离培养第三节细胞组分的分离和培养,3,本次课主要内容,第四节细胞化学和细胞内分子示踪技术第五节细胞功能基因组学研究技术第六节生物大分子的结构测定,4,第四节细胞化学和细胞内分子示踪技术,细胞化学技术（cytochemistrytechnique)一类将细胞形态观察与细胞成分分析结合起来，是在保持组织或细胞原有结构的情况下利用生物大分子、小分子、无机离子的物理、化学特性来研究他们在细胞内的分布、数量级动态变化。细胞化学技术不是单一的技术，而是一整套有关联的技术，包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术、原位杂交技术等,5,一、酶细胞化学技术通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。,6,光镜样品：固定（酶固定结构固定）冷冻切片细胞化学反应（酶反应捕捉反应）光镜观察电镜样品：固定（酶固定结构固定）切组织片细胞化学反应（酶反应捕捉反应）脱水包埋超薄切片电镜观察,7,举例：过氧化物酶peroxidase,(POX)1.原理血细胞中的POX能分解H2O2而释放出新生态氧，后者可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。2.正常阳性细胞:.中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。.嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。.单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。,8,中性粒细胞呈粗颗粒强阳性,单核细胞呈弥散弱阳性,9,二、免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry）利用抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性的特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法。,10,宫颈鳞癌细胞的免疫组化染色,宫颈鳞癌细胞的免疫组化染色,显示NRDRB1蛋白在宫颈鳞癌组织中有特异表达，棕色为阳性表达。,11,三、放射自显影术(autoradiography)放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。常用的弱放射性同位素35S、14C、3H等及强放射性同位素32P。,12,缺点：观察固定后的细胞内分子分布情况，与活细胞中的分布存在一定距离。活细胞内分子示踪技术,13,四、活细胞内分子示踪技术（一）离子探针进行细胞内离子的实时监测原理：一些染料专一地与某种离子结合后会产生荧光或改变本身荧光的发射波长与强度，从而通过荧光检测可以显示该离子的量。应用：细胞内离子的实时检测。,14,(二）绿色荧光蛋白（GFP)应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋白之间的相互作用。原理：构建荧光蛋白基因与目的蛋白基因的融合基因表达载体，转染特定细胞，可以在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察目的蛋白在细胞内的位置及随时间变化情况。特点：融合蛋白不影响目的蛋白的真实定位，荧光蛋白仅仅是一个和标记物。缺点：无法对几种蛋白质检的相互作用提供直接证据。其他荧光蛋白：黄色荧光蛋白（YGP)、蓝色荧光蛋白（BGP)、青色荧光蛋白（CGP)等,15,16,17,（三)荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋白之间的相互作用。原理：当荧光工体与荧光受体分子彼此接近而供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠时就会通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移，一种非辐射能量跃迁，通过荧光显微镜可以观察到这种改变。特点：受、供体的激发光要足够分得开；供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。常见的FRET荧光染料Cy3-Cy5；Alexa546-Alexa647；TexasRed-Tetramethylrhodamine等。,18,19,（四）单分子示踪单分子荧光成像优势：样品激发范围小，光子收集效率高，高量子产能高信噪比荧光基团及低成本荧光。应用：配体与受体地结合、蛋白质的集合和解释，蛋白、mRNA等生物大分子的动力学行为及蛋白、病毒的示踪。原子力显微镜优势：在溶液和室温下进行操作、分辨率高，适合生理条件下显示生物分子的特异性相互作用。,20,第五节细胞功能基因组学研究技术,一、基因表达的定量分析二、基因表达的上调和下调技术三、蛋白质相互作用的研究技术四、蛋白质与核酸的相互作用研究技术五、生物芯片技术六、蛋白质组学技术七、高通量测序技术八、模式动物个体水平的基因操作技术,21,一，基因表达的定量分析（一）印迹杂交技术定量检测基因表达变化的基本方法Northernblotting检测特异性mRNA的技术，变性处理（甲醛、戊二醛）。WestenBlotting检测蛋白质分子，可检测同一蛋白质不同修饰方法，如磷酸化、甲基化、泛素化，考察蛋白质含量、大小、和活性状态的重要方法。优点：低成本、结果准确、少有假象。缺点：低通量的检测技术、步骤繁琐、花费时间长，,22,23,（二）原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)基因表达的时空信息基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物,24,25,U,U,U,G,G,C,U,A,G,A,A,G,C,G,A,U,C,C,C,G,U,C,C,G,A,C,G,RNA探针,待测mRNA,酶标抗体,标记物,原位杂交原理,26,（三）荧光实时定量PCR（Real-timePCR）检测基因表达表达的常规方法1985年，KaryMullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。1993年获得了诺贝尔化学奖。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。,27,聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）：是在体外对特定的DNA序列进行的重复性复制反应（扩增）。反应体系：模板DNA；耐热的DNA聚合酶；引物；4种脱氧核苷酸（dNTP）；反应缓冲液。,28,实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。反应步骤：(1)95变性：DNA双链解离；(2)55退火：DNA链与引物互补结合；(3)72延伸：DNA聚合酶作用下的互补链合成。,29,二、基因表达的上调和下调技术基因克隆：指cDNA克隆，即将mRNA逆转录形成的cDNA或通过体外聚合酶链式反应得到的基因片段，插入到能进行自我复制的载体（通常是质粒），实现在受体细菌内大量扩增的过程。转染（transfection）：将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现上调细胞中的目的基因表达。,30,（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要方式,31,（二）RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是通过小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)造成目的mRNA特异性降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，从而使基因转录后沉默的一种现象。,32,三、蛋白质相互作用的研究技术研究蛋白质相互作用是理解细胞生命过程的关键。（一）免疫沉淀偶联在凝胶颗粒或磁珠上的目的蛋白的抗体将细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合沉淀出来，在此过程中能够与目的蛋白发生相互作用的蛋白被同时沉淀下来，利用SDS-PAGE、免疫印迹或生物质谱等技术队沉淀中的蛋白进行鉴定。缺点：无法动态检测，存在假阳性。应用：验证蛋白-蛋白的相互作用。,33,34,（二）酵母双杂交视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。将这两个质粒共转化于酵母细胞中。酵母细胞中诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。缺点：只能说明两个蛋白之间有相互作用的结构基础，并不标示这两个蛋白在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞中确实存在，需要用免疫共沉淀进行验证。,35,36,（三）吞噬体展示可筛选存在相互作用的蛋白质被筛选蛋白cDNA与噬菌体的衣壳蛋白DNA构建成融合基因，使被筛选蛋白在噬菌体的表面进行表达；将目的蛋白固定在平板或小珠上，与展示不同筛选蛋白的噬菌体文库进行孵育；洗去未结合噬菌体，分离特异性结合的噬菌体，噬菌体扩增，多次重复上述分离过程富集特异性结合的噬菌体，基因测序得到基因编码蛋白。,37,四蛋白质与核酸相互作用的研究技术蛋白质与核酸（DNA和RNA）的相互作用是基因表达调控的基础。蛋白质与基因组DNA相互作用参与基因转录水平的调控、蛋白质（RNA结合蛋白，RBP)与RNA特性结合完成转录水平和翻译水平的RNA加工、修饰、转运、定位和降解等过程。,38,（一）染色质免疫沉淀技术研究DNA和蛋白质的相互作用染色质免疫沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，简称ChIP）原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。交联反应的逆转和DNA的纯化，DNA的鉴定。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。,39,40,（二）紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白相互作用应有：在全基因组水平揭示RNA和RBP相互作用。原理：用254nm紫外光照射使细胞中的RNA分子与RNA结合蛋白发生共价结合，以RBP的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀后，回收其中的RNA片段，经过逆转录后对RNA分子测序，进而发现RNA与RBP之间的相互关系。应有限制性酶切位点和识别序列的引物进行逆转录，可使CLIP分辨率达到单个碱基水平，即iCLIP。缺点：交联效率低，难以区别结合和非结合RNA序列，254nm可诱发细胞DNA损伤并结合新的RBP。改进技术：光活化核糖核苷增强的交联免疫沉淀技术（PAR-CLIP),紫外交联免疫共沉淀测序(CLIPseq)即紫外交联免疫沉淀结合高通量测序.,41,五，生物芯片技术应用：基因差异表达分析，DNA测序、基因突变及多态性扫描，基因组DNA突变及染色体变异检测原理：采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。按照芯片上固定的生物分子的不同，可分为：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片及组织芯片。从其功能不同的角度，又可分为：测序芯片、表达芯片和比较基因组杂交(CGH)芯片。,42,基因芯片（Genechip）又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。,43,44,45,蛋白质芯片(proteinchip)利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。,46,六蛋白质组学(proteomics)技术蛋白质组（proteome）Proteinsexpressedbyagenome（基因组表达的所有蛋白质）,指在特定时空条件下某种细胞、组织或器官所有含有的全部蛋白质。蛋白质组学(proteomics)以特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质的存在即其活性方式为研究对象的学科。,47,双相电泳技术质谱法蛋白质鉴定质谱：电喷雾电离质谱（ESI-MS)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)蛋白质的质谱测序：串联质谱（MS/MS）,48,七、高通量测序技术高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称深度测序(deepsequencing)，“下一代”测序技术（Next-generationsequencingtechnology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。,49,原理：将DNA固定在芯片上，测序反应以大规模陈列姓氏排列，边合成边测序，不依赖于电泳，陈列上的DNA合成石的单个碱基改变所发出的荧光信号被检测器捕获并转化为一个测序峰值，从而获得序列信息。荧光信号可以由被荧光标记的dNTP产生，也可以由DNA合成时所触发的酶催化底物激发出的荧光形成。主要有Roche的454焦磷酸测序技术、Illumina公司的Solexa聚合酶合成测序技术、ABI公司的SOLiD连接酶测序技术。,50,51,与其他技术结合：与逆转录技术结合，可进行高通量的RNA测序，即RNA-seq；与染色质免疫共沉淀（ChIP）或紫外交联免疫沉淀（CLIP）结合，形成ChIP-seq或CLIP-seq技术、与基因组甲基化检测技术相结合，形成Methyl-seq技术。,52,八、模式动物个体水平的基因操作技术基因敲除(knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能。,53,采用方法1.把待研究的基因DNA直接注射到受精卵的细胞核中。2.在培养的胚胎干细胞（ES细胞）基因组中改变或加入一个基因，随后把所有基因改变的ES细胞注入胚泡，使其成为内细胞团的一部分。是基因敲除的常见方法。,54,55,第六节生物大分子的结构测定,生物大分子的结构域功能有着密不可分的关系，特别是对于种类繁多、结构复杂的蛋白周三维结构的分析，是掌握生物大分子功能，理解生命现象的重要手段。,56,一，磁共振技术核磁共振光谱（NuclearMagneticResonanceSpectroscopy,NMR）原理：将自旋核放入磁场中，用适宜频率的电磁波照射，它们会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，检测这种信号，并以波谱的形式显示。主要的自旋核为氢原子核。优势：不需要蛋白质结晶；在溶液中进行检测便于检测蛋白质结构变化，如自身折叠或与底物结合时的变化；可以测定RNA分子的三维结构和糖蛋白中的复杂的糖侧链的结构特点。,57,二，X-射线衍射技术X-射线衍射技术（X-raydiffraction，XRD）是利用晶体形成的X射线衍射，对物质