婴幼儿配方食品和乳粉中串联四级杆质谱的检测方法

RWWCHINADAIRYNETRPGYCHINAJOUMA1NETCN中国乳品工业DARYINDUSTRY婴幼儿配方食品和乳粉中串联四级杆质谱的检测方法郎昭滨，程纲领，马世波圣元营养食品有限公司，山东青岛266400摘要建立了婴幼儿配方食品和奶粉中生物素超高效液相色谱一串联四级杆质谱UPLCMSMS的检测方法奶粉经水溶解再用高氯酸沉淀蛋白，过ENVICARB固相萃取柱后，去除奶粉基质的干扰在UPLCMSMS条件下，对奶粉中的生物素实现定量分析。工作曲线呈线性，R09996，回收率在907910429L间，相对标准偏差均小于8，定量限为O0257GG，本方法灵敏度高，抗干扰能力强是分析婴幼儿配方食品和奶粉中生物素的理想方法关键词超高效液相色谱一串联四级杆质谱；生物素；奶粉中图分类号TS2527文献标识码A文章编号10012230200909003903MILKPOWDERANDFORMULAFOODSFORINFANTANDYOUNGCHILDRENDETERMINATIONOFBIOTINCONTENTBYUPLC_。MSMSLANGZHAOBIN，CHENGGANGLING，MASHIBOSYNUTRACOMPANY，QINGDAO266400，CHINAABSTRACTTHEAIMISTOSETUPAMETHODTODETECTBIOTININFORMULAFOODORMILKPOWDERFORINFANTBYUSINGULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMQUADMPOLEMASSSPECTROMETRYUPLCMSMSAFTERBEINGDISSOLVEDBYWATER，THEMILKPOWDERWASTREATEDBYPERCHLORICACIDTOELIMINATETHEMILKPROTEIN，ANDTHENEXTRACTEDBYENVICARBSOLIDEXTRACTIONCOLUNLNAFTERTHEINTERFERENCESOFMILKSUBSTANCEHAVINGBEENREMOVED，THEQUANTITYOFBIOTININTHEMILKPOWDERWASDETERMINEDBYUPLCMSMSALINESHAPECANBEPRESENTEDINTHEANALYTICALCURVE，RO9996，THERECOVERYWASBETWEEN9079AND10429，THERELATIVESTANDARDDEVIATIBNWASLESSTHAN8，ANDTHEQUANTIFICATIONLIMITWAS00257DGGSINCEITSHIGHSENSITIVITYANDHIGHANTIINTERFERENCEPERFORMANCETHEMETHODCANBEUSEDTODETERMINEBIOTININTHEFORMULAFOODORMILKPOWDERFORINFANTKEYWORDSULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRY；BIOTIN；MILKPOWDER0引言生物素维生素H，分子式为CNO，S，分子量为24431U_11白色至类白色结晶性粉末或无色结晶在热水与稀碱中溶解在水和乙醇中极微溶解在空气中和受热时均稳定不易氧化。遇强碱或氧化剂则分解不溶于有机溶剂，在普通温度下相当稳定，但高温和氧化剂可使其丧失活性目前生物素的检验普遍采用微生物法紫外分光光度法以及酶联免疫ELISA法、高效液相色谱法液一质联用技术LCMSESIL8和荧光检测技术等本方法针对婴儿配方乳粉基质复杂，生物素含量少的特点采用固相萃取使生物素得到净化、富集，并采用超高效液相色谱一串联四级杆质谱UPLCMSMS外标法测定。收稿日期20090517作者简介郎昭滨1963一，男，高级工程师，从事乳制品检验方法研究。1实验11材料生物素标准品。乙腈色谱纯，无水乙醇优级纯，氨水优级纯，高氯酸优级纯，甲酸色谱纯，甲酸色谱纯。所有试剂，如未注明规格，均指分析纯所有实验用水如未注明其他要求，均指三级水。12仪器超高效液相色谱一质谱质谱仪LCMSMS配有电喷雾离子源ESI，固相萃取装鼍，ENVICARB石墨化碳黑小柱，高速离心机O15000RMIN，PH试纸范围为014其他实验室常用仪器与设备。13方法131生物索标准曲线的制备标准溶液的配制称取100MG生物素标准品。用超纯水无水乙醇11定容至100INL配制成质量浓度为100MGL的储备液。标准工作液可根据需要，用样品洗脱液除储备液外，其余中间液及工作液都用洗脱液稀释稀释到所需的浓度。V。O。L。37。,。N。O。9。20。09TO。TAL22639测定方法INSPECTIONMETHODS132样品前处理称取样品100G，用10N1L水将样品溶解并转移至25ML的容量瓶中加入1ML质量体积分数为60的高氯酸后用水定容并摇匀。样品经高速离心机15000RMIN，5MIN，20离心后，再用带02M滤膜的注射器过滤取21IJ滤液于50ML烧杯中，向其中加入5ML水再用氨水质量体积分数5调至碱性，用PH试纸范围114蘸取少许检测，然后将样液过固相萃取柱ENVICARBLG，用10INL水洗柱，水洗后柱子用希尔球吹干然后柱子用12RNL洗脱液2甲酸乙腈32洗脱整个固相萃取过程流速不超过1MLMIN收集洗脱液在4O下氮气吹至9ML约30MIN振荡均匀后上机检测。133沉淀剂的选择1用盐酸作蛋白沉淀剂。用盐酸代替方法中的高氯酸用浓度B5MO1L的盐酸将样液调到PH值为45其余过程同方法132。2用三氯甲烷作沉淀剂。用3MLZ氯甲烷代替方法中的高氯酸其余过程同方法1323用乙腈作沉淀剂。称1G样品用10ML水将样品溶于25ML的容量瓶中，用乙腈定溶至刻度摇匀后离心。用O2PM虑头过滤。并取该滤液2ML于50ML的烧杯中用氮气尽可能将滤液中的乙腈吹净加5ML水稀释该样液然后上固相萃取柱其余过程同方法132。134固相萃取洗脱液选取将1P,GML的生物素标准液过柱然后553J用12ML的如下溶液进行洗脱收集洗脱液并上机测试比较其峰面积的大小。试验洗脱液为100乙腈、2甲酸溶液乙腈2080、2甲酸溶液乙腈5050、2甲酸溶液乙腈6040、2甲酸溶液乙腈7030、5甲酸溶液乙腈6040和15甲酸溶液乙腈6040本文也用甲醇替代上述溶液中的乙腈进了如上洗脱液测试实验135固相萃柱的选取分别选择了MAXENVLCARB的固相萃取柱按132样品前处理步骤，进行承载量对比试验136液相色谱条件WATERSACQUITYHSST3COLUMN21MM100RNLRL，18M，柱温为35；样品室温度为15；流速为03MLMIN；进样量为满环流动相为质量体积分数为01甲酸水溶液一乙腈，梯度洗脱见表1137流动相的选择分别用浓度为10MMOLL的乙酸胺、水、体积分数为008的甲酸溶液、体积分数为012的甲酸溶液和体积分数01甲酸溶液分别与一定量乙腈做流动相进行试验，用1GL的标样在不同流动相条件下进样，上机测试比较其峰面积大小138质谱条件电离方式为ESI；毛细管电压为30KV；锥孑L电压为22V；二级锥孑L电压为3V；聚焦透镜电压3005V；表1梯度洗脱参数源温度为110OC；脱溶剂温度为350；脱溶剂气流量为550LH；锥孔反吹气流量为50LH；碰撞室真空度为278X10PA；质谱定量方式为MR2VL定量法参数如表2所示。表2生物素的质谱MRM参数注为定量离子。2结果与讨论21生物素标准曲线的线性方程配制质量浓度分别为05，10，25，50，10，25GL的6个标样按本方法确定的方法条件进样结果如图1所示浓度1G。图1生物素标准曲线由图1可以看出生物素在质量浓度为0525PT,GL的范围内，呈现良好的线性关系。回归系数R099982I2生物素回收率的测定称取6个10G样品，作为样品测定；另各称6个1G样品并分别向其中加入02G标样，然后按照样品处理方法进行处理，上机检测，结果如表3所示。表3生物素回收率实验结果注样品RSD为346；样品加标RSD为2727。从表3中得知方法回收率在907910429之间。23样品隔日测量差异取一组样品做隔日进样比较，结果如表4所示。表4样品隔日测量差异结果4DINSPECTIONMETHODS测定方法由表4可以看出样品的EL间测量差异很小样品在此期间内的稳定性很好。24检出限与定量限的测定按UPLCMSMS的方法条件对某一奶粉样品进行了测试，该样品生物素的LCMSMS多反应监测质量色谱图见图2。时间RAIN图2生物素的LCMSMS多反应监测质量色谱由图2中信噪比可得出方法的检出限LODSN3为000771IXGG；定量限LOQSN10为00257TA,GG。已满足奶粉一般强化到008GG的指标值。25检出限与定量限本方法中最终收集的样液中质量体积分数4O的乙腈溶液E40C氮吹条件下。吹除了大部分乙腈，提高了生物素在收集液中的浓度、从而达到降低检出限的目的。如果要取得更低检出限，还可对收集液作更长时间的氮吹完全吹除收集液中的乙腈最大程度地提高了生物素在收集液中的浓度，这将会更大程度地程度地降低检出限。26质谱条件的选择及各项参数的优化。生物素在大气压负源与正源条件下母离子的棒状图如图3所示。卅7231I日9241F。柳砰。图3生物素在大气压负源与正源条件下母离子的棒状由图3可以看出生物素在大气压正源条件下母离子棒状图的丰度远比负源的高。因此，选用了大气压正源来做电离源。通过改变碰撞能寻找定量离子的最佳碰撞能结果如图4所示通过改变碰撞能寻找定性离子的最佳芝118EVLJL篇肆鬻翟I，S。篇鬻鬻翟I，SODAUGHTERS245E芝】14EVI耸兽罱；慧；3哿L需；DAUGHTERS245E8】04B日E5搴罱嚣L搴I2I鬻I；L早罱鬻曙2K2712S4,50，乏53E5D4_LL图4通过改变碰撞能寻找定量离子的最佳碰撞能蠢啪J_ILDAUGILTERSOT245ES2271，2683舞L0B。581839199022；N，蒜。82。918401990I，D，0【8F。9如11B391990202542922”L10425EV21B1861日3919900B27052一。7萼0OEV122818畸。1阳92090L2451。7OAUG，J2。，。，。1O，图5通过改变碰撞能寻找定性离子的最佳碰撞能碰撞能结果如图5所示。由图5中最大的丰度值可以找到定量离子与定性离子的最佳碰撞能见表2。27蛋白沉淀剂的选择表5不同的蛋白沉淀剂测得回收率对比蛋白沉淀剂回收率盐酸调PH沉淀蛋白三氯甲烷沉淀蛋白乙腈沉淀蛋白高氯酸沉淀蛋白58566097由表5可以看出其它各沉淀方式测得的回收率均不如用高氯酸体积分数为60作沉淀剂测得的回收率好因此选取本方法所使用的高氯酸体积分数为60作方法使用的沉淀剂。VO137,NO92009TOTAL22641卅件水巡卅卅测定方法INSPECTIONMETHODS28洗脱液的选择表6不同固相萃取洗脱液测得的回收率对比由表6可以看出用2甲酸溶液乙腈6040作为洗脱液溶出率最高本文也将甲醇替代乙腈进了实验结果溶出率相当但考虑流动相中使用的是乙腈，为防止样品中的甲醇影响柱子的平衡状态因此选择了乙腈。29固相萃取柱的选择分别选择了MAX与ENVICARB的固相萃取柱进行了对比试验结果发现ENVICARB固相萃取柱比MAX固相萃取柱富集生物素的能力更强因此实验中选择ENVICARB固相萃取柱作为实验用柱。210流动相的选择表7用不同流动相测得的峰面积流动相B峰面积10MM01L的乙酸胺水体积分数为012甲酸溶液体积分数01甲酸溶液552363827167459774183结束语生物素的同位素内标法是国际上通常采用液一质连用检验方法，但同位素内标价格昂贵，如用同位素内标检验会极大的提高中小企业的检验成本。本方法针对婴儿配方乳粉基质复杂，生物素含量少的特点利用固相萃取使生物素得到净化、富集，用超高效液相色谱一串联四级杆质谱UPLCMSMS外标法测定从而取代了必须使用生物素同位素内标的内标法测定。婴幼儿配方食品和奶粉中生物素超高效液相色谱一串联四级杆质谱UPLCMSMS的检测方法灵敏度高抗干扰能力强。检验速度快是分析婴幼儿配方食品和奶粉中生物素的理想方法参考文献1黄兴国生物素及其营养作用口饲料博览，200371719F刘学剑生物素的生理功能及其应用进展卟饲料博览，20007435【3刁立兰，王燕，李秀珍生物素测定方法的分析11山东食品发酵，2007，214547504黄兴国贺建华易昌华生物素的研究与应用湖南饲料，2003220225蒋静生物素的营养研究进展卟饲料博览，200121516I61AHEMEDJ，VERMAKKDETERMINATIONOFDBIOTINATTHEMICROGRAMLEVE1TALANTA1979L71CHANGYS，WUCH，CHANGRJ，ETA1DETERMINATIONOFBIOTINCONCENTRATIONBYACOMPETITIVEENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYELISAMETHOD，JBIOCHEMBIOPHYS1994293213298HOLLERU，WACHTERF，WEHRLIC，ETALQUANTIFICAFIONOFBIOTININFEED，FOOD，TABLETS，ANDPREMIXESUSINGHPLCMSMSJOUMALOFCHROMATOGRAPHYB，2006831816【9J9KAMATAK，HAGIWARAT，TAKAHASHIM，ETA1DETERMINATIONOFBIOTIONINMULTIVITAMINPHARMACEUTICALPREPARATIONSBYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYWICHELECTROCHEMICALDETECTIONJ0UMAIOFCHROMATOGRAPHY1986，356326330上接第10页高钙共沉淀乳蛋白。高钙共沉淀乳蛋白中钙质量分数为254表明其还可以作为钙源3SDSPAGE3V析结果表明共沉淀蛋白由酪蛋白和乳清蛋白共同组成并且高钙共沉淀乳蛋白中乳清蛋白更多4共沉淀乳蛋白的凝胶性和乳化性明显好于酪蛋白，但是保水性则低于酪蛋白可以作为蛋白质配料应用于食品加工参考文献【1FOXPFMILKPROTEINSASFOODINGREDIENTSJINTERNATIONALJOMNA1OFDAIRYTECHNOLOGY，2001，542415521靳烨乳蛋白共沉淀的制备以及在食品工业中的应用】食品工业，1995437383】VIKRAMVMANUFACTUREANDAPPLICATIONOFHIGHMILLPROTEINPOWDERJINRA，EDPSCIENCES，2002，8215155224】ENNISMP，MULVIHILLDMMILKPROTEINSFMHANDBOOKOFHYDROCONOIDS，LONDONCRCPRESS，BOCARATON，FL，2000189217【5IMULVIHILLDMPRODUCTION，FUNCTIONALPROPERTIESANDUTILIZATIONOFMILKPROTEINPRODUCM1LLONDONELSEVIERAPPLIESSCIENC