螺旋藻藻蓝蛋白在碳酸饮料中的稳定性研究

2食品研究与开发第31卷第期民叩WLJ丌蹑基础研究螺旋藻藻蓝蛋白在碳酸饮料中的稳定性研究张少斌。梁玉金，郭俊美。汪澈沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110161摘要采用羟基磷灰石层析的方法从钝顶螺旋藻分离得到藻蓝蛋白，藻蓝蛋白在碳酸饮料中的稳定性研究表明碳酸饮料中的藻蓝蛋白在低温，弱光，高蛋白浓度，短时间保存条件下稳定性最好。多因素分析表明，对碳酸饮料中藻蓝蛋白稳定性影响的强弱顺序为温度保存时间光强。关键词螺旋藻；藻蓝蛋白；碳酸饮料；稳定性；多因素分析STUDIESONTHESTABILITYOFPHYCOCYANIONUSEDINCARBONICACIDDRINKZHANGSHAOBIN，LIANGYUJIN，GU0JUNMEI，WANGCHEBIOLOGICALSCIENCEANDTECHNOLOGYCOLLEGE，SHENYANGAGRICULTURALUNIVERSITY，SHENYANG110161，LIAONING，CHINAABSTRACTUSINGOFTHEMETHODSOFHYDROXYAPATITECHROMATOGRAPHYTHEPHYCOCYANIONPCWASPURIFIEDFROMTHESPIRULINAPLATENSISTHESTABILITIESOFPCINCARBONICACIDDRINKWERESTUDIEDTHERESULTSWERESHOWASFOLLOWINCARBONICACIDDRINK，PCWASMORESTABLEATLOWTEMPERATURE，WEAKLIGHT，HIGHCONCENTRATIONOFPROTEINANDSHOATIMEPRESERVEDBYMULTIVARIATEANALYSISFROMSTRONGTOWEAK，THEEFFECTFACTORONTHESTABILITYOFPCINCARBONICACIDDRINKWASTEMPERATURE，PRESERVEDTIMEANDLIGHTSTRENGTHINTURNKEYWORDSSPIRULINA；PHYCOCYANIN；CARBONICACIDDRINK；STABILITY；MULTIVARIATEANALYSIS螺旋藻属于蓝藻门，颤藻目，颤藻科的螺旋藻属，是地球上最原始的生命之一，广泛分布于世界各地的水域。螺旋藻有许多种，目前已被分离的大约有30多种，但被广泛开发利用的主要是钝顶螺旋藻和极大螺旋藻【1J。螺旋藻含有丰富的营养保健成分，已有的研究表明，它具有高蛋白、营养均衡、高消化吸收率等独特性质闭，因此被联合国粮农组织FAO誉为“明日最理想的食品”。藻蓝蛋白是水溶性蛋白，在螺旋藻中含量高达干重的10以上，含有大量人体必需氨基酸，容易被人基金项目辽宁省教育厅项目2008663；沈阳农业大学中青年导师基金，植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题资助项目PPB08003作者简介张少斌1973一，男汉，副教授，博士，研究方向蛋白质工程及藻类生物技术。体消化吸收，因此是一个很好的食品蛋白质源3】。藻蓝蛋白作为螺旋藻的光合作用蛋白，可发出强烈并且稳定的荧光，故可利用其制备藻荧光探针用于科研生产实践41。此外，藻蓝蛋白具有亮丽的天蓝色，又可以作为食用色素添加到食品、饮料中。在饮料中3JN藻蓝蛋白，既可以改变饮料的颜色，又可以增强饮料的蛋白质营养价值，因此，研究藻蓝蛋白在饮料中的稳定性具有重要意义。本文从单因素和多因素两个方面对添加到碳酸饮料中的藻蓝蛋白进行了一系列的稳定性研究，为藻蓝蛋白在碳酸饮料中的应用提供一定的试验依据。1材料与方法11材料和仪器111材料钝顶螺旋藻直线型突变株沈阳农业大学生物化5】周林，李元波，曾英超声复合酶法提取三七皂苷的研究J】_中成2003109395药，2006，285642645【6】杨云，谢新年，孟江酶法提取大枣多糖的研究J食品工业科技，收稿日期20090831基础研究食品研究与开发2010年2月第31卷第2期学研究室保存。112药品羟基磷灰石HYDROXYLAPATITEAR，MERCK公司；丙烯酰胺ACRYLAMIDE，甲叉双丙烯酰胺BISACRYLAMIDEAR，SIGMA公司。113仪器紫外线可见分光光度计U一3010HITACHI公司；高速离心机TGL一16B上海安亭科学仪器厂；电泳仪DYY一2C北京市六一仪器厂。12方法121藻蓝蛋白的提取纯化在光照培养箱中培养的螺旋藻鲜藻用网膜过滤，称重后按120的比例加人0001MOLL磷酸盐缓冲液含001MOLL的CAC1，置于冰箱中反复冻融3次，可以看到螺旋藻细胞破裂后溶液变为蓝色。此细胞裂解液经7000G离心15MIN，弃去沉淀，可得到藻蓝蛋白的粗提液，粗提液装入透析袋透析过夜使用0001MOLL磷酸缓冲液，含015MOLLNAC1TSL，将透析后的蛋白液上自制的羟基磷灰石吸附柱，先用0001MOLL磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，然后用003MOLL的磷酸盐缓冲液洗脱藻蓝蛋白，经活性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，保存备用嗍。122藻蓝蛋白的稳定性试验将纯化的藻蓝蛋白与碳酸饮料按一定比例混合，控制混合溶液的起始620NM光吸光值在适当范围，将混合液分装在具塞试管中，每管约3ML，每个处理做3个重复，以碳酸饮料做空白对照，监测处理过程中620NM光吸收值的变化，并观察试验现象。2结果与分析21藻蓝蛋白的分离纯化纯化的藻蓝蛋白经活性聚丙烯酰胺凝胶电泳，不用染色，直接拍照所得结果如图L为蓝色条带。图1藻蓝蛋白的活性电泳FIG1NATIVEPAGEOFPC由图1可见，天然藻蓝蛋白分子量不均一，是B亚基的不同聚集体，与已有报道相同【LJ。通过羟基磷灰石柱层析能很好的将藻胆蛋白PBP中的藻蓝蛋白PC和别藻蓝蛋白APC分开，纯化的藻蓝蛋白用于后续稳定性试验。22藻蓝蛋白单因素稳定性221时间稳定性时问稳定性见图2。时I司，H图2藻蓝蛋白时间稳定性FIG2THETIMESTABILITYOFPC由图2可见，藻蓝蛋白在碳酸饮料中24H之内光吸收值下降较为明显，随着时间的进一步延长，光吸收值下降趋于缓和。推测光吸收值下降逐渐趋于缓和的原因，可能是碳酸饮料在长时间放置的过程中，饮料中的CO逐渐放出，由此改变了溶液的PH值，因而对藻蓝蛋白的影响变小所致。虽然72H的试验过程中，DD锄值下降了近50，但在目测条件下，混合溶液仍然具有较强的蓝色。222温度稳定性藻蓝蛋白在碳酸饮料中的温度稳定性见图3。图3漂蓝蛋自温度稳足性FIG3THETEMPERATURESTABJLITYOFPC由图3可见，藻蓝蛋白在碳酸饮料中室温26OC以下都很稳定，放置7H，其DD值下降只有25左右，目测时溶液蓝色减弱不明显。当温度提高到37以上，藻蓝蛋白光吸收值降低明显，50放置2H，其0D锄值就下降达20以上。因此，如果在碳酸饮料中添加藻蓝蛋白，在储运加工过程中，温度最好不高于26，在直接饮用时，温度最好不高于50。223光强稳定性光强稳定性见图4。62食品研究与开发第31卷第期叩町IJ丌蹑基础研究时IWH图4藻蓝蛋白光强稳定性FIG4THELIGHTSTRENGTHSTABILITYOFPC由图4可见，随着光照时间延长，锄值迅速下降，说明藻蓝蛋白在光照情况下容易变性从而失去蓝色。在3H的处理时间内，光照越强，0D锄值下降越大。因此，藻蓝蛋白在碳酸饮料中应用时，应尽量避免强光的影响。23藻蓝蛋白多因素稳定性为了研究光强、温度、时间三因素对藻蓝蛋白稳定性的相互作用，设计了三因素三水平的正交试验见表1。表1藻蓝蛋白正交试验设计与结果TABLE1THEDESIGNANDRESULTOFPCORTHOGONALEXPERIMENT序号光强温度时间MIN0D下降值由表1可见，温度越低，光强越弱，保存时间越短，既处理1中藻蓝蛋白最稳定，为最佳试验组合。对藻蓝蛋白在碳酸饮料中稳定性影响程度最大的是温度，然后是保存时间，影响最小的是光强。这一结果与别藻蓝蛋白在磷酸缓冲液中稳定性的试验结果相同17。由表1结果可以看出，温度是影响藻蓝蛋白稳定性的最大因素，应在冷饮，或温热的饮料中应用。由于光强的影响程度较弱，在室内使用时，可不用考虑光强的影响。保存时间对藻蓝蛋白稳定性的影响也较大，因此将藻蓝蛋白作为食用色素添加到碳酸饮料中后，应在较短的时间内饮用，否则随着时间延长，颜色会变淡。3讨论采用羟基磷灰石柱层析的方法可以将螺旋藻藻胆蛋白有效分离成藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，利用活性聚丙烯酰胺凝胶电脉可以证明天然藻蓝蛋白以不同的聚集体形式存在。由于藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白本身具有亮丽的天蓝色，整个纯化和电泳过程都处于可观测条件下，因此，它们也可用于蛋白质相关实验教学系统。将藻蓝蛋白添加在碳酸饮料中，在室温26、弱光条件下很稳定，短时间内目测其蓝色几乎没有变化，因此，藻蓝蛋白可以作为碳酸饮料色素添加剂使用，不仅可以调节饮料颜色，还可以提高其蛋白质营养价值。多因素分析表明，温度对藻蓝蛋白的稳定性影响最大，其次是时间，影响最小的是光照，因此在藻蓝蛋白作为色素使用过程中，首先考虑的是使用温度，最好在冷饮或室温条件下使用，添加在碳酸饮料中最好及时饮用，如需保存，最好避光条件下冷藏。参考文献1胡鸿钧螺旋藻生物学及生物技术原理M】北京科学出版社，2O038L一972李中岳螺旋藻的开发利用J1生物学杂志，1994，57122263】刘鲁宁，黄芳，黄业立螺旋藻酒中藻蓝蛋白稳定性影响因素的研究LJI酿酒，2004，31342444吴萍，顾铭，戚艺华