生物大分子的提取

最好的答案2.1概述在自然科学，特别是生命科学高度发达的今天，研究蛋白质、酶、核酸等生物大分子的结构和功能是探索生命奥秘的中心课题，而研究生物大分子的结构和功能则是先解决生物大分子的准备问题，以充分纯度的生物大分子的准备工作为先，对结构和功能的研究就无从谈起了。但是生物大分子的分离、纯化和制造是一项非常细致而困难的工作。l与化学产品的分离制造相比，生物大分子的制造具有以下主要特征。l生命体的构成极其复杂，往往包含数百种或数千种化合物。l许多生物大分子含有非常细微的生物材料，分离和纯化很多，过程很长。l很多生物分子一旦离开生物内部的环境，就很容易被停用。因此，在分离过程中如何防止停用是生物大分子萃取准备的最困难的部分。l生物大分子的制造几乎在溶液中完成，很难准确估计和判断温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种成分的复合影响。l生物大分子的制造通常可以按照以下步骤进行：l决定要准备的生物大分子的目的和要求是研究、开发或发现新物质。l确立制造生物大分子的关键，相应的可靠分析法。l通过文献调查和初步实验，掌握生物大分子目的产物的理化性质。l生物材料粉碎和预处理。l分离纯化程序的选择和探索是最困难的过程。l 1维电泳1带、2维电泳1点或HPLC和毛细管电泳均匀(即纯度)生物聚合物制剂要求最高点。l产品浓缩、干燥和保存。ll分析和测量方法主要有两种。l生物学、物理和化学的测量。l生物学的测量主要包括酶的测定方法、蛋白质含量的多种测定方法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；l物理、化学方法主要包括比色法、气相色谱和液相色谱、光谱(紫外/可见、红外和荧光等分光光度法)、电泳、核磁共振等。l为了快速方便地进行分析测量，将尽可能多的仪表分析方法用于实际操作。l生物大分子的物理和化学性质主要是：水和各种有机溶剂的溶解度。l生物大分子在不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性。l固态对温度、含水量和冻干稳定性的影响。l各种物理特性：分子的大小、穿膜的能力、带电荷的情况、在电场中的行为、离心沉淀的表达、各种凝胶、树脂等填料中的分布系数。l其他化学性质：对各种蛋白酶、水解酶稳定性及各种化学试剂的稳定性。l对其他生物分子的特殊亲和力。l制造生物大分子的分离和纯化方法多种多样，主要利用它们之间的特定差异，例如分子的大小、形状、酸碱、溶解度、溶解度、极性、电荷以及与其他分子的亲合性。l各种方法的基本原理可以概括为l两个方面利用混合物中多种成分的分布系数的差异，在盐析、有机溶剂沉淀、色谱、结晶等两个以上相进行分配。l将混合物放在某一相(大部分是液体)上，通过物理力场的作用，将各组分为不同的区域，实现电泳、离心、超滤等分离目的。l目前纯化蛋白质等生物大分子的核心技术是电泳、断层扫描、高速和超速离心力。l2.2生物大分子制备预处理l2.2.1生物材料选择l要制造生物大分子，首先要选择适当的生物材料。物质的来源不仅仅是动物、植物、微生物及其代谢产物。l高含量，丰富的来源，简单的准备过程，低成本，要尽可能保持新鲜，尽快加工。l动物组织首先去除结缔组织或脂肪等不活动部分，切碎后从适当的溶剂中提取，如果所需的成分在细胞内，首先粉碎细胞。l植物必须先去壳，去除脂质。l微生物物质要及时分离菌和发酵液。l生物材料如果暂时不提取，就要冷冻保存。动物材料需要深冻保存。l2.2.2细胞分裂l不同生物或同一生物不同部位的组织，这些细胞很容易破碎，也使用不同的方法。例如，动物器官的细胞膜软弱易碎，植物和微生物由于由比较强的纤维素和半纤维素组成的细胞壁，必须采用专业化的细胞分裂方法。l(1)机械法：l1)研磨：将破碎的动物组织放入泥浆或匀浆机中，加入少量石英砂研磨或均质剂。l2)组织研磨机：这是一种比较激烈的粉碎方法，通常可以用家用食品加工机粉碎组织，然后用1000r/min 2000r/min的内部刀式组织研磨机(即高速分离机)粉碎组织中的细胞。l(2)物理学方法：l1)冻融法反复：把要粉碎的细胞冷到-15 到-20 ，然后放在室温(或40)下，通过快速融化的方式多次冻融，在细胞内形成冰粒，使其余细胞液的盐浓度升高，从而发生细胞膨胀和粉碎。l(2)超声波处理方法：该方法是用超声波的振动动力粉碎细胞壁和细胞器。粉碎微生物细菌和酵母需要更长的时间。l(3)挤压法：这是温和彻底粉碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa的高压下，细胞悬浮通过小孔突然释放到大气压力中，细胞就完全破裂了。l(4)热和热交替法：可以从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸。(。在90 保持几分钟后，立即放入冰浴冷却，这样反复多次，大部分细胞都会破裂。l(3)化学和生化方法：l1)溶出法：新鲜生物材料在一定的pH和适当的温度下保存，细胞结构会因蛋白质和酯酶等自身拥有的多种水解酶的作用而溶解，释放细胞内容物。l(2)扩张法：细胞膜是天然的半透膜，在低渗透溶液和低浓度稀盐溶液中，溶剂分子进入细胞，使细胞膜膨胀，释放细胞内容物。l(3)酶解：利用溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、酯酶等多种水解酶，处理37、pH8、15分钟，可以特异性地降解细胞壁。l(4)有机溶剂处理：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)处理细胞，溶解细胞膜，使细胞破裂。这种方法也可以与粉碎方法结合使用。(。ll2.2.3生物大分子萃取l“提取”是在分离和纯化之前，将预处理或粉碎的细胞放置在溶剂中，使分离的生物分子充分释放到溶剂中，并避免以原始自然状态失去生物活性的过程。l影响提取的主要因素包括：l目的提取溶剂中产物的溶解度大小；l从固体到液体的扩散并不容易。l溶剂的pH值和提取时间等。l正常：l极性物质溶于极性溶剂，非极性物质溶于非极性溶剂。l碱性物质溶于酸性溶剂，酸性物质溶于碱性溶剂。l温度增加，溶解度增加。l远离等电点的pH值会增加溶解度。l提取时选择的条件应有利于提高目的物的溶解度及维持生物活性。l水溶液萃取：l蛋白质和酶的提取一般基于水溶液。稀盐溶液和缓冲液具有良好的蛋白质稳定性和溶解性，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子需要注意的几个主要影响因素如下。l1)盐浓度(即离子强度):l离子强度对生物大分子的溶解性有极大的影响，某些物质(如DNA-蛋白质复合体)在高离子强度下的溶解性增加。l绝大多数蛋白质和酶，像在纯净水中添加少量中性盐一样，在低离子强度溶液中具有高溶解度，蛋白质的溶解度比在纯净水中时大幅度增加，被称为“盐溶解”现象。溶盐现象主要是产生少量离子的活动，减少偶极分子间极性组的静电吸引力，增加溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。l为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。在水溶液中加入蔗糖或甘油会降低极性，而离子强度(如KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4)增加时，溶液的极性也会增加。ll(2) pH值：蛋白质、酶和核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。应尽量避免过酸、过碱，一般在pH=6 8范围内提取溶剂的pH在蛋白质和酶的稳定范围内，一般选择偏离等电点。l3)温度：为了防止变性和分解，制造活性蛋白和酶，提取时一般可低温操作0 5。l(4)防止蛋白酶或核酸酶的分解。通过添加抑制剂或调节提取物的pH、离子强度或极性等方法，阻止想要激活和纯化其水解酶的蛋白质、酶及核酸的分解。l5)搅黄和氧化：搅黄可以促进提取物的溶解，一般适合轻轻搅拌，太快容易产生很多泡沫，与空气接触面变大会引起酶等物质的变性不活化。由于大部分蛋白质中含有相当数量的巯基，某些巯基往往是活性部位所需的组分，如果提取物中有氧化剂或与空气中的氧过量接触，将巯基氧化成分子内或分子间的二氧化合，从而失去酶活性。在萃取物中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸，防止巯基氧化。l有机溶剂萃取l一些蛋白质和脂质的结合经常在水、稀盐、稀酸、稀碱中使用不同比例的有机溶剂萃取，这些蛋白质和酶比较硬，或分子中有很多非极性侧链。l常用的有机溶剂包括乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等，这些溶剂与水互溶或部分互溶，具有亲水性和亲水性。l稀蛋白和酶溶解在含有稀酸、稀碱和一定比例有机溶剂的水溶液中。在这种情况下，利用稀有机溶液萃取往往可以防止水解酶的破坏，去除杂质，提高精制效果。l例如胰岛素(见讲义p36)。2.3生物大分子的分离纯化l生物体的组成成分非常复杂，数千种生物分子和数千种生物分子存在于同一系统中，因此不能有适合每种分子的一定分离程序，但分离大部分分离工作核心部分的基本手段是相同的。l为了避免盲目，节约实验探索时间，要注意参考和参考前人的经验，避免迂回。常用的分离纯化方法和技术包括：l沉淀(包括盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等)、离心、吸附色谱、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和层析、快速制造液相色谱和等电聚焦准备电泳等。本章主要介绍沉淀法。l2.3.1沉淀法l沉淀是将溶液的溶质从液相变成固相析出的过程。沉淀法(即溶度法)操作简单，成本低，不仅用于实验室，还用于特定生产目的的准备过程，在分离、纯化生物大分子，尤其是蛋白质和酶的制造中使用最多。通过沉淀将目的生物大分子留在固相沉淀或液相中，与杂质初步分离。l根据溶剂中不同物质的溶解度进行分离的基本原理是溶质分子与溶质和溶剂分子之间亲和力的差异引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质和结构有关，溶剂成分的变化或添加、溶液的pH值、离子强度和极性的变化，溶质的溶解度可以显着变化。l生物聚合物制造中最常用的几种沉淀方法如下：l中性盐沉淀(盐析法):多用于各种蛋白质和酶的分离和纯化。l有机溶剂沉淀：主要用于蛋白质和酶、多糖、核酸及生物小分子的分离纯化。l选择性沉淀(热变性沉淀和酸碱变性沉淀):主要用于去除特定耐热和恒定pH值下变性的其他蛋白质。l等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质和其他性物质的沉淀，但此方法单独使用较少，多与其他方法一起使用。l有机聚合物沉淀：以聚乙二醇为主要沉淀剂的快速发展新方法。l2.3.1.1中性盐沉淀(盐析法)l在溶液中添加中性盐沉淀生物大分子的过程称为盐析。除蛋白质和酶外，多肽、多糖、核酸等还可以用盐析法沉淀分离。l盐析方法是应用最广泛的，还是在蛋白质领域有80多年的历史，其卓越的优点包括：l成本低，不需要特别贵的设备。l操作简单安全。l对许多生物活性物质有稳定的影响。l中性盐沉淀蛋白的基本原理l蛋白质和酶都溶于水。这种分子的- COOH，- NH2和-oh都与极性水分子相互作用，形成水合层，围绕蛋白质分子形成1 nm 100n m粒子的亲水胶体，削弱蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性组越多，水合层就越厚，蛋白质分子和溶剂分子之间的亲和力越强，溶解力也越大。亲水胶体在水中有两个稳定性因素：电荷和水膜。中性盐的亲水性比蛋白质和酶分子的亲水性大，因此添加大量的中性盐后，夺取水分子，破坏水膜，暴露疏水区域，同时中和电荷，破坏亲水胶体，蛋白质分子就会立即沉淀。盐析图见下页的图4。l中性盐选择l常用的中性盐中，最重要的是(NH4)2SO4，因为它比其他普通盐种类有很好的优点：l(1)溶解度大：特别是在低温下，它也有相当高的溶解度，在其他盐类中是找不到的。酶和各种蛋白质通常在低温下稳定，因此盐析工作也要在低温下进行(0 4)。从下表可以看出，0 时硫酸铵的溶解度比其他盐类高得多：l表2-1几种盐在不同温度下的溶解度(水克/100毫升)l0 20 80 100 l(NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103Na2so 4.9 18.9 43.3 42.2 lNaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101lllll2)分离效果好：部分提取物添加适量硫酸铵l盐析，一下子去除75%的杂蛋