细胞工程实验报告

细胞工程实验报告专业：生物技术课：0801人：灵感团学号：308040305一、实验目的1、了解与动物细胞培养相关的实验设备和实验前设备的清洗和消毒、无菌室灭菌及消毒等基本方法，建立灭菌工作的概念。2、了解动物细胞原代培养的基本方法，熟悉掌握、组织块法和消化法培养的基本操作过程。初步掌握无菌手术技术。3、细胞超低温冷冻在恢复中学习和理解储存基本原理，早期掌握培养细胞现有的超低温冷冻复苏玻璃化超低温冷冻的方法。4、掌握ELISA法测定抗体效价，细胞低温冷冻保存和复苏，MTT法测定细胞活性。5、学习制造饲养层细胞的方法，掌握，准备制造杂交细胞。6、学习在脾脏组织中制造免疫细胞的方法，在免疫脾脏中制造用于杂交细胞融合的免疫细胞悬浮液。7、学习和掌握动物性细胞融合的基本方法，以免疫脾细胞和骨髓瘤细胞融合制造和选择异种杂交瘤细胞。8、学习细胞形态的观察和分析、细胞技术等细胞培养中常见的问题。二、实验原理1、原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内提取的细胞、组织或器官，在体外培养，然后持续到第一次传递。原代培养首先从无菌状态下取出想要的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或通过消化分散成单个自由细胞，在人工培养条件下持续生长和繁殖。2，MTT法测定细胞活性MTT法在细胞线粒体呼吸链中将丁二酸脱氢酶四唑蓝还原为不溶性青紫晶体梅朗，测定二甲基亚砜(DMSO)溶解的490nm中的吸收值，吸收值间接反映细胞的活性状态和活细胞数。3、培养细胞的低温冷冻保存在恢复中。为了维持细胞株(系统)的遗传稳定性和非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞深低温冷冻保存技术。目前细胞低温保存技术主要有两种方法：传统的低温保存和玻璃化超低温保存。活细胞可以在低温下克服分子间的热运动，在不影响活力的情况下长期保存。如果没有任何条件直接冷冻细胞，细胞内及外部环境中的水会形成冰晶，导致细胞内机械损伤、电解质上升、渗透压变化、脱水、PH变化、蛋白质变性等，从而导致细胞凋亡。在培养液中添加保护剂可以降低冰点。在缓慢的冻结条件下，可以在细胞内的水分冻结之前使细胞显露出来。-130 以下低温保存，可以减少冰晶的形成。4、馈线细胞准备在体外培养细胞实验中，困难的细胞或更少的细胞，通常在培养瓶或培养板底部放入活的原代细胞或定向肿瘤细胞，以帮助辅助目的细胞的生长。它可能在培养细胞的过程中释放一些细胞生长刺激因子或提供细胞接触的信号。5、免疫脾细胞的制备小鼠经抗原多次免疫后，脾脏组织细胞能分泌相应抗体的更多b淋巴细胞可以分裂分化，如果脾脏内细胞连接不畅，可以用机械分离和过滤网进行筛选，用自由的单细胞悬浮液制造这些细胞。6、杂交瘤细胞制备(细胞融合)将免疫动物b细胞与永久性细胞株之一融合，将杂交后代称为杂交后代。异种杂交瘤细胞可以结合分泌特异性抗体b细胞的遗传特性和骨髓瘤细胞株增殖的遗传特性。淋巴细胞克隆只产生一种特定抗体。细胞融合技术产生的异种杂交瘤细胞可以维持父母的特性。杂交细胞的筛选在体外发展了很多增殖，得到了必要的抗体。7、ELISA测试将抗原或抗体结合到一种固相载体表面，保持其免疫活性。将抗原或抗体与特定酶联系起来，同时保持免疫活性和酶活性的酶抗原或抗体。检查对象标本(测量抗体或抗原)和酶标记抗原或抗体以不同的阶段与固相载体表面的抗原或抗体反应。用清洗的方法，将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，最后结合固相载体的酶量在标本中检验的物质量上占一定比例。添加酶反应用基质后，基质被酶催化成为有色产品，产物的数量与标本中被检查物质的数量直接相关，因此可以根据颜色反应的亮度进行定性或定量分析。酶的催化频率高，大大扩大了反应效果，测量变得非常敏感。三、实验内容1、动物细胞培养技术2、杂交瘤技术与单克隆抗体制备3、细胞工程相关技术1)动物细胞培养实验设备的准备无菌室：首次启动的无菌室一般用福尔马林熏蒸(5 6 m2无菌室用KMnO4 50g倒入100毫升甲醛，用烟雾和24hr时间，用无甲醛气味中和)，经常使用的无菌室在每次实验前必须打开紫外线0.5至l小时，然后暴露0.5至l小时后才能工作。培养设备消毒：干燥热灭菌法：玻璃器皿、金属器具等消毒方法，140 150，2 3小时；湿热灭菌方法：橡胶制品、无菌服装、瓶盖和口罩、杀菌过滤器解毒、蒸压灭菌15磅20-30分钟；紫外线照射杀菌：多孔培养板的杀菌-30分钟。细菌提取：培养基等(培养基通过0.22过滤装置-杀菌)2)杂交瘤技术和单克隆抗体制备1、鼠标免疫方法：脾直接注射：抗体可在一般免疫后3 4天制造。l不同途径注射：一般以3次，2 3周间隔维持免疫。步骤：0.2毫升羊静脉血(肝素或枸橼酸钠抗凝剂)L 0.9%NaCl或PBS 1000 1500rpm，5分钟离心5分钟，涤纶3次清洗，收集血细胞。将细胞浓度从0.9%NaCl或PBS调整到4107 /ml(10/cell)的血球计数板数。l腹腔注射0.5ml血细胞悬浮液到小鼠。每15天进行重复注射，以强化免疫，2次重复2次，2次免疫强化后10天检测血清效价，血清效价低的话，继续保持免疫力。l小鼠处决2 3天前1次免疫强化激活b淋巴细胞。注：单元数：大方块分为16个中间方块。每个大矩形边的长度为1mm，复盖封面幻灯片后，幻灯片和封面幻灯片之间的高度为0.1mm，因此计数室的体积为0.1m3。大矩形分为16个中间矩形。每个大矩形边的长度为1mm，复盖封面幻灯片后，幻灯片和封面幻灯片之间的高度为0.1mm，因此计数室的体积为0.1m3。细胞浓度(狗/ml)=细胞数/体积，即细胞浓度(狗/ml)=一个大细胞数104。侵入的免疫红细胞数必须在一定范围内，细胞数过多会产生免疫耐受；得到的免疫细胞太少。2、小鼠血清制备取5只未免疫的老鼠-每只老鼠眼球取0.5毫升以上，取自1mLEP管。-老鼠杀死短颈，放入含有75%酒精的燃烧器消毒，带进灭菌室。在37 的水中除去血清，将30min2000的离心10min用作ELISA在干净的离心管中的语音对照5只经免疫处理的小鼠作为ELISA阳性对照3、单克隆抗体制备工艺4、骨髓瘤细胞培养1、旺盛的生长，选择好形态的细胞L2，将上等液倒入离心管，剩下的附着细胞用0.02%EDTA消化液消化细胞5分钟，然后倒入相同的离心管，在1000 1500 rpm处用离心力收集细胞5分钟。将含有L3，6mL 10%小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞分成2个细胞培养瓶，培养到5% CO2培养箱37 。5、馈线细胞准备1、每组1只鼠标切断脖子，浸泡在75%的乙醇中，消毒5分钟。2、在无菌室内将鼠标腹部皮肤切细，暴露腹部，用注射器将3 4 ml 1640培养液注射腹腔，暂时按摩。3.注意左手用镊子夹腹部肌肉，右手用剪刀剪小嘴，用吸管吸离心管。4、使用一次低速离心洗涤细胞后，使用1215ml 1640培养液悬浮细胞(5104)提取100200 ml滴96孔板(通常为吸管23滴)。5、免疫脾细胞的制备1.免疫采集血清后，将浸泡在75%乙醇中的老鼠带入无菌室。小心切开腹腔，取出脾脏。3.用一次性注射器扎几个脾脏，用3 4ml PBS溶液吹出脾脏。4.收集飞细胞悬浮液，在低速离心洗涤后将细胞悬浮在培养液中。6、杂交瘤细胞制备(细胞融合)1.以1333610的比例混合骨髓瘤细胞(2107)和脾细胞，低速离心后丢弃，用手指均匀反弹细胞。2.1 ml50%的PEG(PEG)在1分钟内慢慢混合的细胞中，然后加入PEG(PEG)，摇晃离心管。3.peg作用一分钟后，迅速滴下培养物，终止peg作用，低速离心洗涤细胞。4.将10mLDEME培养液悬浮融合细胞以每个孔3滴的量放入有营养层的96孔口中，放入37 5% CO2培养箱中进行培养。(注：由于实验时间有限，我们只是练习单克隆抗体的制备方法和过程，单克隆抗体的制备过程及操作注意事项已经基本理解。)，以获取详细信息3)原代细胞培养小鼠肝组织：的组织块培养1.去除肝脏，冲洗PBS三次，然后放在表面盘子上。2.用从表面碟子到滴管装入少量PBS(RPMI1640是20%小牛血清，0.2%白蛋白，10ug/ml胰岛素，100U青霉素，链霉素)的锋利剪刀，将组织块切成约1mm3的小块。3.用弯头镊子将组织的小块移植到细胞病中排列。各组织相距约0.5厘米，每瓶粘贴20 30个小块，将细胞病倒置，组织块一侧朝上，然后添加培养液3毫升。4.将细胞病放入37 ，在5% CO2培养基中静置24个小时，将瓶子轻轻翻转，将组织块浸入培养液中，继续停止培养。5.72小时后在显微镜下检查，如果看到细胞生长在组织边缘，可以在3-5天内改变部分或全部培养液，在大部分组织块的生长晕倒时进行继代培养。肝细胞培养实验结果：l培养培养基为淡黄色，清澈，一般可见细胞生长良好。l培养3 5天，通过相位差显微镜观察，细胞在组织边缘生长，更换部分或全部培养液，碰到大部分组织块的生长，小心地选择组织块，继续培养3 4天。l大约7天后，生长光晕扩大到直径15毫米左右的小鼠肝细胞原代培养的生长光晕，是一组多边形上皮细胞和纺锤细胞混合的细胞。L24 48小时后培养液呈黄色浑浊，表明受到污染。l培养液变成紫色，通常细胞生长不好，培养液pH值太高。小鼠肾细胞：的消化培养1.剖腹消毒后的老鼠，取出肾脏，在有PBS的培养皿中冲洗。2、尽可能地切肾。3，用PBS洗涤2 3次。添加4，5毫升胰蛋白酶，37 (30分钟)。5，筛选，1000离心力10分钟，用PBS洗涤23次。6、添加培养液，3 5105/ml(每1.5个)。7、细胞悬浮瓶3mL CO2培养基培养。4)抗体IgG ELISA检测1.取0.2毫升羊红细胞，重复6ml PBS 1000rpm离心10分钟洗涤一次。2.去除红细胞，混合1.2毫升磷酸盐缓冲液(na 2 hpo 45m mol/l，nah 2 po 45m mol/l ph 7.6)(低渗透率)，常温下20-25分钟，412000-13000 rpm3.取乳白色沉淀(血影)，用包装物稀释后，按50g(老师准备)，放入96孔酶标志，放入湿盒子4冰箱，过夜准备。4.吸入孔中的抗原液(冲击小，防止炮弹抗原脱落)，用清洗液3次(将清洗液沿孔壁注入200mL/孔，放置3分钟，丢弃清洗液，重新注入，再放入废液(含有1%牛血清白蛋白的清洗液)，200mL/孔。5.扔废液，用洗涤液三次。1:000，1:000，1336000，1336000，1336050，1:000稀释后，按下每个孔100uL，在37 下放置湿箱子1小时。还设置语音、阳性和空格调节(零孔调节)。7.用洗涤液洗3次。8.每孔适当稀释的酶标记兔抗小鼠IgG试剂100uL，湿箱内37 ，起1小时的作用。9.用洗涤液洗三次。10.每个孔添加100uL的新制剂溶液(TMB)，在黑暗的地方在室温下作用5-10分钟。11.每个孔100 uL2MH2SO4终止反应，检测。用酶联免疫吸附分析仪测定OD450nm光吸收值，如果检测孔的光吸收值大于或等于语音孔的光吸收值2.1以上，则可以确定为阳性。注：TMB，2MH2SO4操作时戴手套，TMB中过氧化氢对皮肤有腐蚀作用。酶板在工作中不能用手接触地面，影响折射率，在测量吸光度值时，需要烘干地面的水。)，以获取详细信息5)细胞的低温冷冻保存和恢复V1 .老鼠断了脖子，死亡后，分别取肾(被切断的)、脾(注射器被吹走的)细胞，用10001500rpm离心5min收集细胞。V2 .用1640培养液将细胞悬浮，计数，细胞密度调整为51062 107 /ml，分别为0.8ml，3管，以下处理后-196(液氮)冷冻保存。分组：a组：直接冷冻保管；b组：10% DMSO-1640培养液中细胞悬浮冻存；c组：细胞采用10%的玻璃化保护剂(PVS2)，4 转移5min，4 1000rpm离心10min，报废，100% PVS 2保护剂，4转移5min后冷冻保存；(注：比较用MTT方法测量细胞活动的三种方法时，为了减少误差，按c组进行平行离心AB组。)，以获取详细信息3、MTT测定细胞活动1.从液氮中取出冷冻管，直接投入到37 40 的水中，随时摇晃，快速(在一分钟内)融化。2.转移到1.5ml离心管后，添加0.5ml 1640培养液，1500rpm离心5min，收集细胞。3.用0.5ml 1640培养液悬浮细胞，然后加入80uL MTT反应液，在37 的水中培养3小时。4.15002000rpm离心5min，抛弃，细胞收集；再