细胞自噬检测

2.5细胞裂解将细胞从培养皿上刮下后，在15毫升无菌塑料试管中用PBS洗涤3次，每次洗涤用10毫升重悬液完全悬浮，并在4下于5009离心5分钟。所有的操作都在冰上进行。在最后的洗涤步骤中，将细胞转移到1.smlePpendorf试管中。将细胞完全重悬于TAP细胞裂解物中。裂解缓冲液的体积根据细胞体积来确定(一般来说，每10个四川细胞的塔布化合价r为100四川到200四川)。放在冰上30分钟，每10分钟用移液管吹一次细胞，使其完全悬浮。以100009高速在40下离心15分钟，将上清液转移到新的试管中进行下一次实验，并丢弃沉淀物。2.13细胞自噬活性的检测我们主要通过两种方式诱导细胞自噬：饥饿处理和雷帕霉素处理。是在饥饿处理中，从正常培养的细胞中吸取培养液，用PBS仔细清洗细胞三次，注意不要使它们变薄。从培养皿中分离细胞，加入15毫升ebss(剂量取决于培养皿的大小)以及2微升的ED64和pePstatin。在37的培养箱中培养24小时。对于雷帕霉素处理，添加到正常细胞培养液中的最终浓度为主要有两种方法来检测细胞的自噬活性，一种是用绿色荧光蛋白-LC3转染条带，用荧光显微镜观察LC3在细胞质中的聚集。第二种方法是用抗westemblotting和LC3抗体检测细胞内内源性LC3n的增加。为了荧光显微镜分析，将GFP-LC3转染入U20S细胞。24小时后，将细胞在带有盖玻片的6孔板中传代培养，诱导自噬，吸去培养液，用PBS仔细冲洗载玻片一次，向每个孔中加入3%多聚甲醛，在室温下用封闭光摇动载玻片20分钟。用PBS冲洗载玻片3次，向每个孔中加入2毫升，室温下摇动10分钟。用固定液将盖玻片固定在载玻片上，室温下干燥1分钟，然后用荧光显微镜观察。对于westemblott5m5ming分钟，从培养皿中收集药物或饥饿处理后的细胞，加入1SdS蛋白负载缓冲液，并进行超声波处理直至其不粘。95”e煮沸样品5分钟，在室温下高速(100009)离心5分钟，通过SDS-pAGE和LC3抗体(sigma)进行westemblotting检测。自噬活性越高，细胞中LC3n的带浓度越高。1.2.1自噬检测实验分为三组：自噬诱导组、自噬抑制组和雷帕霉素组。自噬诱导组： 1105 RAW264.7细胞培养至对数生长期，加入50 nmol/L雷帕霉素3小时。然后按照感染多重性(MOI)=110的比例加入1109 CFU/升H37Rv菌株培养3小时。将PBS (pH 7.4)缓冲液洗脱3次，以洗脱未结合的H37Rv菌株。自噬抑制剂组： RAW264.7细胞加入自噬抑制剂3MA(600mg/L)36小时，然后H37Rv菌株按照MOI=110的比例接种3小时。在雷帕霉素组中，将：个RAW264.7细胞培养至对数期，并加入50 nmol/L雷帕霉素3小时。胰酶消化后收集上述各组细胞，用20 g/L锇酸固定过夜，透射电镜观察自噬形成。1.2.2菌落形成单位(CFU)检测胰酶消化后收集自噬诱导组和自噬抑制组的细胞，加入双倍体积的双蒸馏水溶解细胞，以7000 r/min离心，收集沉淀。再悬浮后，将沉淀物以1: 107稀释，将100 L悬浮液接种到7H10培养基中，在37培养21天进行菌落计数。结果2.1自噬检测雷帕霉素作用于RAW264.7细胞后，用H37Rv菌株感染细胞。透射电镜显示细胞内出现大量由单层膜组成的自噬小泡。同样，雷帕霉素组可以诱导自噬形成。然而，在用自噬抑制剂3MA处理RAW264.7后，在细胞中没有发现自噬泡(图1)。2.2 CFU试验感染细胞后，H37Rv菌株被裂解、稀释并接种到7H10培养基中。经过21天的培养，CFU被计算在内。自噬诱导组H37Rv株的CFU值为4.120.32，而CF1.3免疫荧光观察施用长春瑞滨后A549细胞中LC3蛋白表达的变化将A549细胞接种在6孔板中经聚赖氨酸处理的盖玻片上。在细胞粘附到壁上后，加入一定浓度的长春瑞滨以同时建立阴性对照和空白对照。培养不同时间(0-24)h后，将4%多聚甲醛固定在盖玻片上15分钟。固定细胞用PBS洗涤两次后，加入0.25% Triton-X100冰，静置5分钟，用PBS洗涤两次，然后加入1%牛血清白蛋白(BSA)30分钟，加入用1% BSA稀释的羊抗人MAPl-LC3-II (1: 200)，在4孵育过夜，第二天用PBS洗涤三次，加入用LFITC标记的兔抗山羊IgG(1% BSA用l: 20稀释)，在室温下暗孵育30分钟用PBS再次洗涤细胞，在室温下用对数/毫升pi和核糖核酸酶A核DNA染色30分钟，并在激光共聚焦显微镜下观察。1.4流式细胞仪定量检测细胞自噬按照上述1.3方法收集LC3免疫荧光染色细胞(空白对照组和阴性对照组同时建立)后，用4预冷的PBS洗涤两次，然后用含4%甲醇的甲醛将细胞固定在冰上两次，用PBS洗涤两次，用80%冰乙醇固定，置于20冰箱中过夜，用PBS洗涤两次固定细胞， 然后加入1%牛血清白蛋白l00ix l重悬细胞，加入用1%牛血清白蛋白(1100)稀释的兔抗人膜糖蛋白LC3ii，在4孵育。用PBS洗涤次级内皮素细胞3次后，加入F11C标记的山羊抗兔抗体(1%牛血清白蛋白以120的比例稀释)，并在室温下黑暗孵育30分钟。 PBS再次清洗细胞。流式细胞术检测LC3荧光水平的变化，反映自噬的比例。平衡盐溶液的制备平衡盐溶液是林格根据生理盐水首先创造出来的，由无机盐和添加成分葡萄糖等组成。平衡盐溶液旨在使哺乳动物细胞短期存活，而不是促进它们的生长。平衡盐溶液用于清洗组织和细胞，稀释作用于细胞的试剂和药物，并维持生理酸碱度和渗透压。1.汉克斯平衡盐溶液汉克斯平衡盐溶液是一种含磷酸盐的缓冲溶液，当暴露在空气中时可以保持生理酸碱度。因此，它通常被用作细胞或组织的酶消化和细胞洗涤的优选溶液，然后最终将细胞置于培养基中。汉克斯平衡盐溶液配方汉克斯平衡盐溶液(HBSS)组分分子量浓度(gm/L)摩尔浓度(mM)无机盐：氯化钾(KCl) 75 0.4 5.33磷酸二氢钾(KH2PO4) 136 0.06 0.44碳酸氢钠(碳酸氢钠)84 0.35 4氯化钠(氯化钠)58 8 138磷酸氢二钠(Na2HPO4) 142 0.048 0.34其他组件：葡萄糖180 15.6酚红)398 0.011 0.032.磷酸盐缓冲溶液磷酸度贝克斯缓冲溶液配方磷酸度贝克