维生素C生产工艺综述

维生素c生产技术综述摘要：介绍了维生素c的性质、功能和用途。 综述了维生素c生产技术的发展历程和发展趋势。 着重探讨了微生物发酵法生产工艺的进展。 介绍了两步发酵法的研制现状，探讨了2 -酮- L-葡萄糖醛酸的分离提取工艺。 展望了我国维生素c生产技术的前景。关键词：维生素c，功能，两步发酵法，发酵，2 -酮-l-葡萄糖醛酸，分离提取thevoverviewontheproductionprocessofvitamincabstract : characters functinfunctionsandsusesofvitamincoareintdued.deventermenterprocesandtrendofindustructionaltiontecontr RR obiologiollogrationmentmethedofthe2stepsfermentationmethod is introduced， theseperationandproficationprocessesof2- keto-l-gluconicacidarediscussed.thedirectionofindustricaltiontectronvitamidinchinaprever键words :维护c，功能，步骤框架方法，框架，2键全局连接acid，分区和扩展维生素C(vitaminC，以下简称Vc )又称L -抗坏血酸(L - ascorbicacid )，是人体必需的水溶性维生素。 Vc广泛存在于生物组织中，在新鲜水果、蔬菜、动物肝脏等中含量丰富。 绿色植物可以自己合成Vc，但人和许多动物肝脏没有氯氧化酶，不能自己合成，必须从外界摄取。1 .维生素c的性质、功能和用途1.1性质纯维生素c在常温下是无色结晶，有酸味，易溶于水。 Vc结晶状态稳定，但在水溶液中不稳定，容易被加热、氧化破坏。L-抗坏血酸具有很强的还原性，在体内通过抗坏血酸氧化酶的作用被L-抗坏血酸脱氢氧化，该脱氢反应是可逆反应。 还原型l -抗坏血酸和氧化型l -脱氢抗坏血酸具有生理活性，它们构成的一对氧化还原系统在细胞代谢中起着重要的生理作用1 .1.2功能和用途Vc参与了人体中具有广泛生理作用的：1 )体内的氧化还原反应2 ； 2 )对抗自由基损伤3 ； 3 )改善机体免疫功能4 ； 4 )参与胶原蛋白与细胞间质的合成2 ； 5 )参与神经递质的合成2 ； 6 )参与氨基酸代谢和铁代谢2 ； 7 )抑制血小板及白细胞活化2 ； 等等。 因此，Vc在恶血病5 、感冒、心血管缺陷、高胆固醇、糖尿病、精神抑郁症6 、重型克山病等疾病的临床治疗中有着重要的应用。 另外，Vc还可以作为食品添加剂、饲料添加剂、农作物催熟剂、化妆品工业防锈剂6 等使用。2.Vc的生产方法2.1雷氏法雷氏法是德国化学家Reichstein等人于1933年发明的最初工业生产VC的应用方法。 该方法以葡萄糖为原料，通过催化加氢采集D -山梨糖醇，用醋酸菌发酵生成L -山梨糖醇，经酮化和化学氧化水解得到2 -酮- L -葡萄糖醛酸(2 - KLG )，用盐酸氧化得到VC。 利氏法生产的VC产品质量好，收率高。 由于生产原料廉价易得，中间产物的化学性质稳定，至今仍是众多国外VC厂商如Roche、BASF/Takeda和E. Merck等厂商采用的主要技术方法。 然而，赖氏法也有很多缺点。 例如生产工序多、劳动强度大、有毒易燃化学药品大量使用，容易引起环境污染。 因此，从20世纪60年代开始，各国学者一直致力于莱氏法的改良。 其过程如图1所示H2/Ni醋酸杆菌丙酮/H2SO4D-葡萄糖D-山梨糖醇L-山梨糖醇双丙酮-L-山梨糖醇高压O水解化学转化二丙酮酮-2-酮-L-葡萄糖醛酸2- KLC VcNiSO4图1莱法制备Vc的工艺流程2.2两步发酵法我国混合菌发酵技术是上世纪70年代中国科学院微生物研究所和北京制药公司共同建立的，由于包括两个发酵工序，因此称为两步发酵法。 第一步是在醋酸杆菌的作用下将D-山梨糖醇氧化成L-山梨糖醇，转化通称酒精糖，目前国外已经研究了相关基因和转化机制，第二步是在混合菌系统的作用下将L-山梨糖醇进一步氧化成KGA，转化通称糖酸7。 上述混合菌系中含有2种微生物，直接负责山梨生物氧化的微生物通称为小菌，最初被鉴定为葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans )，最近Urbance等8在系统上发现了普通的酮葡萄糖醛酸菌(Ketogulonigenium vulgare ) 另一种微生物俗称大菌，其本身不能转化为山梨糖，作为伴生菌起着辅助小菌生长和产酸的作用。 许多微生物具有这种共生菌的作用，生产中常用的有芽孢杆菌(Bacillus cereus )、巨芽孢杆菌(B.megaterium )、水杨酸菌(B.thuringiensis )等。 目前国内Vc厂商采用混合菌发酵法，该方法是大规模Vc工业生产成功的唯一微生物转化方法，具有糖酸转化效率高的显着优势。 目前，我国Vc生产规模占世界总生产规模的三分之二，其中80%的产品用于出口，是我国医药领域的支柱产业。 混合菌发酵法在国内的成功应用也引起了国外的关注。 1986年，我国的两步发酵法向瑞士霍夫曼拉-罗切公司转让了技术。 其过程如图2所示H2/Cat醋酸杆菌大菌、小菌D -葡萄糖D -山梨糖醇D -山梨糖醇2 - KLG混合发酵化学变化Vc图2两步发酵法生产Vc的工艺流程2.2.1大、小菌关系的研究进展两步发酵法中的两步发酵是通过氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans )和巴西棕榈(bacillusmegarium )的混合发酵实现的，前者是产酸菌的通称细菌，但继代生存率和产酸能力较低。 后者是伴生菌，通称大菌，不产酸，混合培养时产酸显着。 混合发酵中大小菌的关系复杂，是国内外学者研究的热点。魏东芝9提出了大菌提供小菌中某种生长因子促进小菌生长的构想。冯树等人10的研究表明，大菌细胞内液和细胞外液均能促进小菌的生长，大菌细胞外液中具有该作用的成分的分子量在100kDa以上，大菌细胞外液具有促进小菌产酸的作用，在该细胞内液中没有该作用的大肠菌细胞外液中具有该活性作用的组为30-50 其中前者是含铁和锌的蛋白质，该活性蛋白质的形成规律和作用机制尚在探索之中。焦迎晖11等通过分析Vc二步发酵过程中活菌的产酸量、糖酸转化活力等，证明大菌胞外液和细胞内液不直接影响小菌休眠细胞的糖酸转化活力，即大菌的作用只是促进小菌的生长，促酸作用是提高小菌密度的结果。 目前大、小菌的详细混生机制尚不完全清楚，尚待人们进一步探讨。2.2.2菌种选育的研究两步发酵法中两步发酵过程的菌种选育是微生物发酵法生产维生素c的研究热点课题之一，我国学者从事了大量工作。尹光琳等7采用紫外照射、化学诱导和原生质体融合等方法选育的新品种菌系SCB 329SCB 933发酵周期仅4050h，产酸达115130mg/mL，转化率约为90%。焦鹏等 12 采用SMA探针技术HBHG复制技术筛选蛭弧菌J26株，摇瓶发酵产2KLG的发酵单位为5060 mg/mL。 经优化发酵条件，该菌株的发酵单位达83.9%91.7%。许安等利用13离子注入技术选育的2klg高产菌系IPPM1028，其转化率比起发菌M2980提高18.8%，发酵周期为6064h，2klg浓度达到70 mg/mL左右，转化率达到95%。李越中6采用含pUB 110质粒的小菌转化子(KmrSts )和Q132(KmsStr )大菌进行原生质体融合，获得了可连续替代的10多岁小菌，为实现小菌的单独培养和小菌的遗传学研究奠定了基础。陈建华等14采用配对法测定了一株氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)103的优良伴生菌芽孢杆菌(Bacillus pumilus)97002，l山梨糖的转化率达到90%左右。 首先尝试了两菌属间原生质体的融合。两步发酵法两步发酵过程中菌种选育的研究有很多，但仍处于实验室研究和小试验阶段。2.2.3发酵工艺条件的研究微生物发酵是一个极其复杂的生化反应过程。 基质浓度、温度、PH等因素直接影响微生物的生长和产物的形成。 国内一些学者对两步发酵法的工艺进行了深入研究。魏东芝等9研究了VC二步发酵过程的动力学，通过测定发酵过程中大小菌的生长规律和基质和产物的变化，建立了简化的动力学模型，在一定程度上揭示了2KLG发酵系统的本质特征，分析了发酵过程，为指导生产，实现生产连续自动化奠定了基础。张忠泽等人通过优化通气、温度和金属离子等环境因子，显着改善了双菌的共生效应，醇酸转化率提高了2.33%，发酵周期缩短了2.8小时。针对l山梨糖浓度不高的问题，尹光琳等人7通过研究新的菌系SCB329SCB933中添加l山梨糖的技术，可以在避免高糖对菌体生长的抑制作用的同时，利用菌株的优良特性，将基质浓度提高到14%。康学真16等通过测定和分析VC二步发酵中大小菌的比例对酸产的影响，得到了各级种子最佳培养时间、零级种子培养的初始接种量和大小菌的接种比例，在实践中发挥了指导作用。蒋宇扬、张成刚17研制了几种稀土元素化合物，考察了它们在2酮l葡萄糖醛酸还原酶(KGR )和l山梨糖醇发酵中对2klg产酸的影响。 摇瓶试验结果表明，在l山梨糖醇发酵中加入稀土类元素化合物，发酵时间缩短了6小时，2klg产酸量超过6 mg/mL。李越中6采用聚乙烯/海藻酸钙包埋固定大、小菌、活化产酸高于游离菌的种子液的方法，将固定化细胞的半衰期延长至10批。2.2.4提取过程两步发酵法发酵两次后，发酵液中仅含2 - KLG左右，菌丝体、蛋白质、多糖类、浮游微粒等杂质含量高。 这给2 - KLG的分离纯化带来很大困难，后处理费用占总成本的比例很大。 目前VC工业生产中常用的2 - KLG分离纯化方法有加热沉淀法、化学凝集法和超滤法。(1)加热沉淀法加热沉淀法是2 - KLG分离纯化的传统技术，分离手段落后。 该工艺采用氢树脂调节蛋白质的等电点pH值，然后加热去除蛋白质。 采用该工艺，有效成分在高温下降低了降解损失，发酵液直接通过树脂柱，污染了树脂表面，降低了树脂的交换容量和收率。 两次，大量的水分通过树脂柱进入，浓缩能量也增大了。(2)化学凝聚法化学凝集法通过加入化学凝集剂去除蛋白质、菌体、色素等杂质，避免加热沉淀时有效成分的损失。 季辉等 18 采用化学絮凝法预处理VC发酵液，提高2 -KLG滤液的质量，提高提取前产率5. 2%，VC总产率2. 5%以上。 陈雷等19 以壳聚糖为主絮凝剂，聚丙烯酰胺为助絮凝剂，采用化学絮凝法去蛋白技术，提取产率从原来的76%降低到82%，古龙酸的优良品率从原来的35%降低到60%，成本比原来降低了20%。但化学絮凝法也不足，主要是处理后发酵液离心得到的上清液中还存在一定量的蛋白，发酵液染菌后处理效果不明显，上清液浑浊，严重影响产品的质量和收率。 此外，所用的化学絮凝剂也可能污染环境。(3)超滤法超滤是一种新的膜处理技术，该方法具有操作方便、节能、不污染新环境等优点，因此在2 - KLG分离纯化中的应用越来越广泛 20 。 该方法与加热沉淀法的不同之处在于常温下可以操作，可以减少有效成分的损失，在膜去除蛋白质的过程中，没有添加新的化学物质，