植物组织培养技术.ppt

1实验室设置和仪器设备2实验基本操作3培养基成分及其制备4培养条件的选择、植物细胞工程实验室和基本操作、1实验室设置和仪器设备、实验室是进行组织培养研究的主要场所，应满足清洗、培养基制备、贮藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。 1 .基本实验室，1.1洗衣间根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。 在实验室的一侧设置专用清洗水槽，清洗玻璃器具。 在中央实验台上，为了清洗小型玻璃器具需要设置2个水槽。 工作量大的话，你就可以买瓶清洗机。 准备12个清洗液罐，专门用于清洗要求洁净度的玻璃器具。 此外，配置槽架、干燥箱、柜架、超声波清洗器等。 地面要耐湿，排水良好。 面积60平方米左右，装备的主要仪器设备有冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分注器、药品箱、仪器箱、抽油泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容积瓶、储藏瓶等。 冰箱体积180-200L，用于培养基母液、维生素等珍贵药品、彩膜、植物材料的保存。 天平必须是不同的量。 1.2培养基制备期间配备实验台、高压灭菌锅、排气灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒盘、电炉等。 灭菌锅的选择应根据要求选择不同型号的灭菌锅。 一般实验室可选择小型医用便携式高压灭菌锅，大型实验室可选择立式压力和温度自动控制的灭菌锅。 生产性实验室可选用大型卧式灭菌锅。 没有条件，上述工作之间可以整合在一个准备之间，设备设置和布置合理，房间宽敞明亮，通风，地面清洁，防滑。 1.3消毒期间，无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，故又称接种室。 通常由正反两部分构成，外侧之间是缓冲之间，用于准备作业，也具有防止污染的作用。 缓冲室的门必须与接种室的门错开，两扇门也不能同时打开，无菌室不能被带入门或者进出口。 缓冲室设有水槽、实验台、鞋帽架、橱柜和紫外线灯。 无菌作业室的内壁必须用塑料板或瓷砖装修，作业人员进入作业室前必须穿上消毒过的工作服或拖鞋。 室内应设置超清洁工作台、紫外线灯、解剖镜、各种接种器具等。 1.4无菌操作室，为了控制培养室的温度和光照强度，培养室的房间不使用窗户，但必须留下通风窗，安装排气扇。 室内的温度由空调控制，光线由荧光灯控制。 天花板和内壁最好用塑料钢板装修。 地板用水磨石或瓷砖铺好，一般分为两个房间，一个是光的培养室，另一个是暗的培养室。 培育室外需要准备和走廊。 培养室需要培养架、床、床、光照培养箱、生化培养箱、自动定时器等。 荧光灯一般为40重量，固定在培养架侧面或架下，每层有两盏荧光灯，距离20cm，光强2000-3000lx。 1.5培养室、2 .辅助实验室、2.1检定室细胞学检定室的功能是培养材料的细胞学检定和研究。 要求清洁、明亮、干燥，不要让各种光学仪器受到湿气和灰尘的污染。 请配置各种显微镜、照片系统等。 生化分析室是以培养细胞产物为主要目的的实验室，必须建立相应的分析实验室，以便随时对培养物的有效成分进行抽样检测。 离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等。 为试管苗提供适合生长的环境条件。2.2、温室、(1)清洗液的制备、2实验的基本操作、1 .清洗技术、a、新购入的玻璃设备表面附着游离的碱性物质时，首先用0.5%的除污剂清洗，用自来水清洗，然后在1%2%的盐酸溶液中浸泡一夜(不能在4小时以内)，用自来水清洗，最后(2)清洗方法为，用自来水清洗至无污垢后，用适当的刷子沾上去污剂(粉)进行清洗，或者浸入0.5%的清洗剂中进行超声波清洗(比色盘不能是超声波)，然后用自来水彻底清洗去污剂，用无离子水洗2次，准备干燥(仪表不能干燥) 清洗过的器皿内外不得沾水珠。 否则再次清洗，再次清洗后仍有水珠的情况下，用洗液浸泡数小时后(或用去污粉擦拭)，再次清洗。 b、使用过的玻璃器具的清洗、聚乙烯、聚丙烯等塑料器具开始被用于生物化学实验。 首次使用塑料制的容器时，首先用8mol/L的尿素(用浓盐酸调整pH=1)洗涤，接着用无离子水、1mol/LKOH和无离子水洗涤，然后用103mol/LEDTA除去金属离子的污染，最后用无离子水完全洗涤，之后每次使用c、塑料容器清洗，金属用品一般不应用各种清洗液清洗(可用新洗涤剂水清洗)，需要清洗时用酒精清洗，火焰干燥。 e、除菌过滤器用清水洗净后，用清洗液洗净，用清水洗净，最后用蒸馏水洗净，晾干。 d、清洗金属用品、(一)、灭菌作业极为重要。 首先，必须确立有菌和无菌概念有菌的范畴：有菌：暴露在空气中的物体，至少在其表面有菌。 例如，植物的表面、超清洁桌面、未处理的工具和手等。 无菌：高压高温处理(工具、器皿、培养基等)物理或化学处理过的健康动植物不接触内外表面的组织内部可能是无菌的(也有内生菌，但不影响培养，不污染)；2 .灭菌，一、物理方法：干热、湿热、过滤(0.25 )紫外线灯、超声波等。 2、化学方法：使用酒精、次氯酸钠、水银、漂白剂、高锰酸钾、过氧化氢水、福尔马林等杀菌剂或抗生素，灭菌方法；干热灭菌玻璃器具、器具湿热灭菌培养基、蒸馏水、器具、棉塞等熏蒸灭菌接种室；培养室过滤灭菌液体培养基；蒸馏水药剂灭菌培养材料焚烧灭菌器具、瓶口、棉塞、包头培养期间，各种灭菌方法及其使用范围适用于玻璃器具和金属器具的灭菌。 操作方法： 150、40min或120、120min发现芽孢杆菌时，160、90120min、(1)干热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。 在121保持2030min的注意点：加足水，放气，气压变为0时，可以打开盖子。 (2)湿热灭菌、培养基灭菌在高压高温下处理，但培养基中的部分成分遇到高温分解(例如部分生长调节剂GA3、玉米等)时，需要过滤灭菌。 另外，酶、血清等也需要过滤灭菌的方法，使生长调节剂和酶达到一定浓度，用注射器注入微孔过滤器，使过滤器的孔径为0.220.45。 制作培养基时，对培养基进行高压灭菌，降至50左右时，加入适量的荷尔蒙后进行分注。 (3)过滤灭菌主要用紫外线灯照射，适用于实验室的空气、工作台等，灭菌时间为2030min。 注意：关灯后进入5min。 洁净桌熄灭后，请打开风扇。 (4)通过放射线灭菌、火焰烧灼达到灭菌目的，适用于接种器具的灭菌。 (5)火焰焚烧灭菌适用外植体、实验器具、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较如下： (6)消毒剂、长期不使用的培养室和接种室必须熏蒸。 方法甲醛、高锰酸钾熏蒸。 甲醛的用量通常以每立方米26毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。 室内准备好后，把好的锰酸钾放进餐具或烧杯里(在餐具或杯子下面铺上报纸，洗干净为好)，甲醛也放进餐具或杯子里，马上离开家关门。 几秒钟后，甲醛溶液沸腾挥发。 高锰酸钾是一种氧化剂，与甲醛的一部分作用后，由于氧化反应产生的热，剩馀的甲醛挥发到气体中。 熏蒸灭菌、甲醛熏蒸接种室至少应在使用前24小时进行。 熏蒸后密闭保持4小时以上后在室内工作。 甲醛对人的眼睛和鼻子有很强的刺激作用。 因此，使用前可以用氨中和。 取与甲醛同量的氨水，倒入另一烧杯，立即放入熏蒸室，使甲醛和氨水发生中和反应，消除甲醛的味道，减少对人体的刺激作用。 要使用氨水，请在工作前两小时进行。 有材料的培养室也可以采用乙二醇加热熏蒸，人为因素(工作人员自身):工作服、帽子、面罩、酒精擦手。 物品要素、器具和器具、培养皿：清洗热压玻璃器具：清洗干热(干热箱)或干接种器具：用CCL4布擦拭加入用湿布擦拭75%95%醇烧制、培养基：湿热、培养材料、外部细菌：用水洗涤用化学药剂处理内部细菌，茎尖培养中使用抗生素：青霉素、利福平、 操作空气：用洗地板的95%酒精擦拭超清洁工作台的化学药剂熏蒸污染源：三，无菌操作技术，1，实验器具和材料的准备2，75 %的酒精擦拭超清洁工作台，室内和超清洁工作台用紫外线灯杀菌20min-30min。 注意：柜台上的用品不要放得太多或重叠，以免灭菌效果下降。 3、关掉紫外线灯，打开电风扇，5-10min后进入缓冲室，75%洗手和洗手，更换无菌衣服、帽子和口罩。 进入接种室。 (注：没有特殊情况，尽量不要放下桌子)，外植体消毒工序，用4，70-75 %的酒精擦拭桌子，消毒双手。 试验用具也要用酒精消毒。 点燃酒精灯，把金属器具烧在那个火焰上，冷却待机。 注意：所有操作都必须在火焰附近进行并烧灼。 金属设备过度烧灼，不能防止退火。 吸液管不能燃烧。 培养瓶口、塑料材料、橡胶材料，火焰不得过长。 5、取流水冲洗(至少30min )的外植体，用一定消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗34次后放入无菌培养皿中，放置在酒精灯的火焰下，用无菌接种器具进行分离、切断等处理。 6、打开培养瓶，瓶口用灯火焰旋转烧灼，用镊子将培养材料放在培养基上，将烧灼的镊子放回去，烧灼瓶口，做瓶塞。 7 .用酒精擦桌子和手。 执行以下操作： (1)培养时，动作要准确、机敏，即使不太快，也要防止空气流动，增加污染机会。 (2)不得用手触摸消毒过的器具。 接触的时候用火焰消毒，更换用品。 (3)为了方便拿取，桌子上的用品必须合理配置，原则上右手用的放在右侧，左手用的放在左侧，酒精灯放在中央。 (4)工作从头到尾要保持一定的顺序性，在组织和细胞不处理之前，不要早点暴露在空气中。 同样，培养液在不使用之前，不要尽早打开瓶子使用后，如果不再使用，通过立即关闭瓶口直立，可以减少掉菌的机会。 注意： (5)吸取营养液、细胞悬浊液、其他各种用液时，请分别使用吸管。 不得混用扩大污染或引起细胞交叉污染。 (6)工作时对操作区说话或咳嗽，以免唾沫将细菌和支原体带入作业台污染。(7)手和比较脏的东西不能通过开放的瓶口，瓶口最容易受到污染。 装液的时候如果吸管的尖端碰到瓶口，就要把吸管扔掉。 接种时在火焰附近打开瓶口，倾瓶，以免空气中的微生物落入瓶中，正确错误，接种作业必须在火焰附近进行。 而且动作快，正确错误，在接种过程中尽量达到悬空要求，防止操作污染，正确错误，接种时不能用手接触瓶口内壁和瓶口。 正确错误，将瓶口放在上面，接种结束后立即关闭瓶口，接种正确错误的一根火焰器具防止交叉污染的发生，种子和分生组织：培养时通常贴在培养基的表面而不是内部，防止供氧不足，错误地接种茎：形态学的下端插入培养基内注意形态学上端暴露于空气中，错误，用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：一种是生长于自然环境下的植物； 二是温室环境下生长的植物，三是无菌环境下已经体外培养的植物。 四、外植体的选择和处理技术，一、优秀的基因型试验应首先明确目的。 例如，蔬菜、作物等脱毒快，为了消毒病毒，提高产量和品质，应选择当地栽培确认的高产优质品种作为脱毒材料，品种确定。 花卉、观赏植物的繁殖也应该选择有价值的植物。 2、采访采访生长旺盛，精神饱满，无病虫害植株。 母柱代谢旺盛期采摘的外植体再生能力强，试验容易成功。 (1)、外植体的选择、3、外植体大小的选择因外植体而异。 利用茎尖培养，茎尖大小脱毒效果非常显着。 像幼胚培养一样，胚龄也非常重要。 (今后具体为) 4、选择外植体时期外植体的生长动态，多与其它生长规律(体内时钟)有关。 因此，最好在最适合植物生长的时期取材培育。 你会得到很好的结果。 1、取材母株预处理人工管理，母株生长旺盛，代谢活跃，在此基础上取材培育，易成功。 2处理部分外植体休眠植物的种子、幼胚、芽，存在休眠。 为了打破休眠，可以利用低温处理和赤霉素等化学物质处理。 不同植物的处理温度和时间不同。 (2)、外植体的处理、3、组织内生菌的处理(1)加入抗生素，注意抗生素的使用量，将高浓度且容易导致培养物死亡的(2)生长较长的生长点的部位作为最初培养的外植体。 (3)采集被内生细菌污染的培养物的茎尖不断转移。 3、培养基成分及其制备一、培养基成分及其作用(一)无机营养物质培养的植物组织、器官、细胞或原生质体需要连续供给某些无机化学物质，除c、h、o以外，必要量比多的元素称为大量元素，必要量比少的元素称为微量营养元素。 培养基中大量元素的用量通常为每升数十数千毫克。 许多元素是n、p、k、Ca、Mg和s。 培养基中添加量最多的是n，n一般以硝酸盐或氨盐、或者两者结合而成的盐提供，大量元素、微量元素的使用量一般为每升几十毫克以下。 植物必需的微量元素多含有Fe、Cu、Zn、b、Mo、Mn、Co、Cl等化学药品中的微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不要过多，常引起生长抑制等污染现象。 微量元素，(二).有机化合物，有机物质含有维生素类、氨基酸类、糖类物质和其他有机添加物1、维生素类物质维生素类物质，对酶系具有催化功能。 硫胺素(VB1)与愈伤组织的发生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期必需的维生素，但盐酸吡咯烷酮(VB6)促进根的生长，烟酸(VB3，也称维生素PP )促进胚的发育。 还配方有泛酸钙(VB5)、生物素(VH )、钴胺素(VB12 )、叶酸(VBc )、Vc等。2、AA类物质大多数AA适量对培养效果有正效。 常用的是Gly、Asn和Gln。 植物组织培养有时采用水解乳蛋白和水解酪蛋白。 3、糖糖在培养基中的作用：1)、为细胞提供合成新物质的碳骨架2 )、为细胞呼吸代谢提供基质和能量3 )、维持渗透压蔗糖是广泛应用的碳源。 葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。 4、其他有机物1 )肌醇(环己醇)肌醇可形成果胶物质，除了构成细胞壁的物质外，还可形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与