2012第二章 核酸的分离纯化

第二章核酸的分离纯化第二章提取保持一定的离子强度；(4)降低物理因素对核酸降解的机械剪切力。(2)为了防止核酸的生物降解，细胞内外的各种核酸酶可以消化核酸链中的磷酸二酯键并破坏核酸的初级结构。所用的仪器和一些试剂需要高温灭菌。核酸酶抑制剂应添加到提取缓冲液中。1。脱氧核糖核酸酶抑制剂，1)金属离子螯合剂：脱氧核糖核酸酶需要活化金属二价离子Mg2和Ca2，所以使用金属二价离子螯合剂可以抑制脱氧核糖核酸酶的活性。如乙二胺四乙酸二钠等。2)阴离子表面活性剂：如十二烷基硫酸钠，它不仅能抑制核酸酶，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白质结合形成带负电荷的络合物，在高盐溶液中沉淀。2。核糖核酸酶(RNase)抑制剂，核糖核酸酶分布广泛，容易污染样品，且耐高温、耐酸碱，不易失活。常用的核糖核酸酶抑制剂有：(1)膨润土，主要是蒙脱石，化学成分(钠，钙)0.33(铝，镁，铁)2 (硅，铝)4O10(氢)2NH2O。一些阳离子，如镁、钠、钾等。很容易被其他阳离子交换，因此它们具有良好的离子交换性能。作用机理：膨润土带负电荷，能吸附核糖核酸酶并使其失活。(2)DEPC(二乙基焦磷酸盐，C2H5OCOOCOOC2H5)粘稠液体，一种强核酸酶抑制剂。作用机制：蛋白质因与组氨酸结合而变性。注：DEPC还能破坏单链核酸中的大多数腺嘌呤环。但浓度比变性蛋白高100-1000倍。(2)易降解，在4或液氮中保存。提取核糖核酸时，将容器在37下于0.1浸泡2小时。剧毒。(3)肝素肝素；(4)异硫氰酸胍：最有效的核糖核酸酶抑制剂，在裂解组织时也使核糖核酸酶失活，不仅破坏细胞结构，使核酸从核蛋白中解离，而且对核糖核酸酶有很强的变性作用。(5)核糖核酸酶抑制蛋白(RNasin):是从大鼠肝脏或人胎盘中提取的酸性糖蛋白。核糖核酸酶是一种对核糖核酸酶的非竞争性抑制，它能与许多核糖核酸酶结合使其失活。(6)氧钒-核糖核苷复合体(VRC) :是由氧化钒离子和核衣壳形成的复合物，它与核糖核酸酶结合形成一种过渡态物质，几乎可以完全抑制核糖核酸酶的活性。分离和提取核酸的主要步骤(1)细胞破碎(1)高速组织捣碎机捣碎(2)玻璃匀浆器匀浆(3)超声波处理(4)液氮研磨(5)化学处理(SDS，吐温80等)。)6)生化方法(溶菌酶、纤维素酶等。(2)核蛋白的解聚和变性蛋白的去除核酸和蛋白之间的结合力主要是正负静电引力(核酸和碱性蛋白的结合)、氢键和非极性范德华力。分离核酸最困难的事情是分离与核酸紧密结合的蛋白质，同时避免核酸的降解。常用的DNA提取方法：加入10倍体积的缓冲液：10毫摩尔Tris-HCl(pH7.4)；150毫纳克。10毫米数据；0.5%SDS .氯化钠破坏核酸和蛋白质之间的静电引力，破坏氢键并使核蛋白解聚。乙二胺四乙酸二钠与钙结合使脱氧核糖核酸酶失活；SDS能破坏细胞膜，抑制核酸酶和蛋白质中的游离核酸。加入蛋白酶K，它是非特异性蛋白酶。它能把蛋白质消化成氨基酸。一般工作浓度为50 100 g/ml。反应时间为5小时，反应温度为55。酚/氯仿混合使用可增加去除蛋白质和抑制核酸酶的效果。氯仿的比例较大，可以加速有机相和水相的分层，减少水相中残留的苯酚。同时，氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。当用苯酚/氯仿提取核酸提取物时，需要充分混合。为了防止起泡和促进水相与有机相的分离，加入一定量的异戊醇(苯酚：氯：异戊醇=25: 24: 1)。(3)苯酚/氯仿萃取。使用苯酚时应注意。1.苯酚通常是透明无色的晶体。如果苯酚晶体是粉红色或黄色，则表明它含有2.苯酚具有很强的结合水的能力，因此在使用前必须加入抗氧化剂-巯基乙醇和8-羟基喹啉。3.苯酚腐蚀性很强，会导致严重烧伤。操作时应戴手套。提取核糖核酸时的注意事项，核糖核酸提取大多使用强变性剂，如异硫氰酸胍等。它不仅能裂解细胞，还能有效抑制核糖核酸酶活性。因为核糖核酸酶是无处不在的，所以在进行核糖核酸操作时应该防止核糖核酸酶污染。如一次性手套、高温烘烤玻璃器皿、DEPC处理过的液体和塑料制品。苯酚被水饱和了。原理：真核基因的特征和方法：1。寡(dT)-纤维柱2。寡核苷酸(DT)用磁珠标记，核糖核酸(核糖核酸用聚腺苷酸)分离提取，(3)沉淀核酸，沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：改变核酸的溶解缓冲液；(2)重新调节核酸的浓度；(3)去除溶液中的一些盐离子和杂质。盐和浓度为1。脱氧核糖核酸沉淀时，乙醇可以消除核酸的水合层并暴露带负电荷的磷酸基团。盐阳离子的加入可以与这些带电基团结合，以减少沉淀形成位点处多核苷酸链之间的排斥。因此，只有当阳离子的量足以中和暴露的磷酸残余物的电荷时，才会发生乙醇沉淀。(1)乙醇的优点：较少的盐沉淀和挥发去除沉淀中所含的微量乙醇。缺点：需求量大(2 3倍体积)。2有机沉淀剂，(2)异丙醇，优点：体积小，速度快，适用于低浓度、大体积的DNA样品沉淀。通常，它不需要长时间保持在低温下。缺点：盐、蔗糖和脱氧核糖核酸很容易共沉淀。异丙醇难以挥发和去除。(3)聚乙二醇的优点是可以用不同浓度的聚乙二醇来选择和沉淀不同相对分子量的DNA片段。当6000分子量的聚乙二醇用于沉淀脱氧核糖核酸时，所用的浓度与脱氧核糖核酸片段的大小成反比。注：聚乙二醇沉淀通常需要添加0.5摩尔/升氯化钠或10摩尔/升氯化镁。硅胶吸附DNA，(4)精胺，能快速有效地沉淀DNA。原理：精胺与脱氧核糖核酸结合后，溶液中的脱氧核糖核酸结构浓缩沉淀，单核苷酸和蛋白质杂质可从脱氧核糖核酸中分离出来，达到纯化脱氧核糖核酸的目的。聚乙烯亚胺(PEI，简称聚亚胺)是乙烯亚胺的线性聚合物，分子式中的n约为700-2000。其胺基的pKa值在11和12之间，在通常的中性溶液中有大量正电荷，是一种阳离子聚合物。聚乙烯亚胺沉积核酸或蛋白质的原理与盐析法大不相同，效果也不同。例如，NH2SO4用于去除蛋白质的水分子层(水合膜)，这需要例如50%的NH2SO4饱和度。然而，聚乙烯亚胺只需要0.2%(w/v)的浓度就可以直接与酸性蛋白质结合形成絮凝物。因此，聚乙烯亚胺在沉淀物中。(4)聚乙烯亚胺；裴，3岁。核酸沉淀的温度和时间。如果溶液中核酸的浓度非常高，在盐离子的存在下，加入异丙醇等后可以看到DNA的絮状沉淀。如果溶液中核酸的浓度很低，需要在-20过夜。酵母tRNA有助于纳克级核酸沉淀。大于10g/ml的核酸可在冰浴中有效沉淀10分钟。(4)核酸浓度的测定：1。用紫外分光光度法测定核酸含量在波长为260纳米的紫外光下，10D值的吸光度相当于双链DNA的浓度为50微克/毫升；单链脱氧核糖核酸和核糖核酸为40微克/毫升；寡核苷酸为35微克/毫升。应注意的是，外径值应在0.1 0.99的范围内，否则不符合上述线性关系。(5)核酸的保存。在4或-20下，将样品溶解于pH8.0的乙酸乙酯中，或在-70下加入1滴氯仿，可使样品保存数年。将核糖核酸样品溶解于：将0.3摩尔/微升的硝酸纤维素(pH5.2)加入2倍体积的乙醇中，在-70下储存数年。，P1:Dissolve6.06gTrisbase，3.72 na2edta 2 H2 oin 800 mldistilated water . adjustthepto8.0 withcl . adjusthevolumeto1 literawithdistilledwater . add100 grnasaperplierfp 1.p 23360 dissolve 8.0 gn aopelletin 950 mldistilated water，50ml20%SDS(w/v)溶液。thefinalvolumeshouldbe 1 liter . p 3: dissolve 294.5 gpotassiumacetatein 500 mldistilled water . adjusthepto 5.5 withgalaceaticacid( 110ml)。用蒸馏法、碱裂解法提取大肠杆菌质粒，第三节核酸分子杂交技术，用两条单链核酸分子的互补序列在一定条件下按照碱基互补配对退火过程的原理形成双链。杂交的两侧是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称为探针。杂交包括固液相杂交和液相杂交。(1)核酸分子杂交的基本原理，(2)变性方法：(1)热变性：当温度升至90100时，双链核酸分子之间的氢键完全断裂。(2)酸碱变性：当酸碱度低于3或高于10时，双链核酸分子之间的氢键断裂。(3)化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等。断裂双链核酸分子之间的氢键。变性后物理化学性质的变化：粘度降低，密度增加，紫外吸收值增加；4.区域的DNA变性曲线先溶解气相色谱区域，然后溶解逐步曲线；5.气相色谱含量与Tm值的关系，(g-c)%=(Tm-69.3)2.44 Tm=(g-c)% 0.4169.3；(2)复性；1.定义：变性单链核酸分子在一定条件下根据碱基互补原理重组成双链核酸的过程，称为复性或杂交。两条具有互补序列的单链核酸可以互补形成双链：脱氧核糖核酸/脱氧核糖核酸、核糖核酸/脱氧核糖核酸、核糖核酸/核糖核酸、寡核苷酸/脱氧核糖核酸和寡核苷酸/核糖核酸。(2)复性过程(1)单链分子之间的碰撞形成局部双链(2)如果局部双链周围的碱基不匹配，双链再次解离(3)如果局部双链周围的碱基匹配，形成中心序列(4)形成完整的双链分子(2)影响杂交的因素(1)核酸分子的浓度和长度：浓度越高，复性速度越快，分子越大，复性速度越慢，单链探针的浓度越高浓度控制在0.1-0.5 g，浓度过高会影响杂交效率。2.温度：(1)脱氧核糖核酸/脱氧核糖核酸杂交，适宜温度为20-25 (2)核糖核酸/脱氧核糖核酸或核糖核酸/核糖核酸杂交，加入甲酰胺降低Tm值(3)使用寡核苷酸探针杂交，适宜温度比Tm值低5，3。离子强度：低盐浓度下杂交率较低，随着盐浓度的增加，(2)高盐浓度增加杂交率；(2)碱基错配的杂种更稳定。当进行具有不完全序列同源性的核酸分子的杂交时，必须保持杂交反应溶液中的高盐浓度和膜清洗溶液中的盐浓度；(4)甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值和杂交液的温度；与待测核酸的探针杂交在低温下更稳定；当待测核酸与探针的同源性不高时，加入50%的甲酰胺溶液在3542下杂交。(2)如果待测核酸序列与探针的同源性较高， 在68下与水溶液杂交(5)核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指反应系统中存在的不同序列的总长度(2) Cot与反应系统中核酸的复杂性成正比(3)当两个DNA样品的浓度完全相同时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性。 mountofnaturationismmeasureredrarelativetoaccontvalue。the0 valueistheproductofc0(InitialConceconcentrationofdNA)，t(time insenconds)，andconstantthatdependandonthecentrationofconstantinthebuffer .replicatevednawillrenatureatlowc0tvalues，whiecocompleandniquedasequencesswillerantatatatahic0 TVALUES。6。非特异性杂交反应：阻断非特异性杂交位点根据待测核酸是否固定在固相支持物上，第二节核酸分子杂交方法包括固液杂交膜印迹杂交原位杂交液相杂交核糖核酸酶保护分析核酸酶S1保护分析方法、南方印迹杂交、待测核酸样品的制备、裂解或破碎细胞、基因组脱氧核糖核酸3的提取和纯化、限制酶消化成不同大小的脱氧核糖核酸片段，(2)待测脱氧核糖核酸样品的电泳分离，1。琼脂糖浓缩：用低浓度凝胶分离大片段，用高浓度凝胶分离小片段2。凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA移动缓慢，小分子DNA移动迅速，大小相同的分子在同一条带3。分子量标准：DNA经Hind消化。用于杂交的分子量标准可以用核素标记；(3)核酸在凝胶中变性(碱变性)，用稀盐酸脱嘌呤，可以缩短核酸片段，提高转移效率。将凝胶置于氢氧化钠溶液中，使凝胶中的DNA变性为单链DNA、中性缓冲溶液和缓冲溶液。(1)固体支持物的选择，(1)理想的固体支持物应具有以下特征：(1)具有很强的结合核酸分子的能力；(2)不影响与探针的杂交反应；(3)结合核酸分子稳定牢固；(4)具有良好的力学性能；(5)非特异性吸附较少；(4) Southern印迹是指将通过电泳分离的DNA片段转移到某个固体支持物上的过程；(2)普通固体支持物，(1)硝酸纤维素膜：其优点是吸附能力强，杂交信号背景低。缺点是DNA分子结合不牢固尼龙膜：优点是结合单链和双链DNA的能力强于硝酸纤维素膜；缺点：杂交信号背景高化学激活膜：优点：DNA与膜共价结合；它对不同大小的DNA片段具有相同的结合能力。缺点：结合能力低于上述两种膜。2.南方印迹法是一种常见的方法。毛细管虹吸印迹利用浓盐转移缓冲液的推动作用将DNA从凝胶转移到固体支持物上。基本原理：容器中的转移缓冲液含有高浓度的氯化钠和柠檬酸钠。上吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过