第五章重组DNA技术.ppt

第五章重组DNA技术,以LNX1基因的表达载体构建进行说明,第一节重组DNA技术的主要工具,一限制性核酸内切酶,定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,BamH,分类、（基因工程技术中常用型）,类酶识别序列特点回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,重组DNA技术中常用的工具酶,第二节载体,载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)含有能被宿主细胞基因表达系统识别的表达元件、从而可以在宿主细胞内表达目的基因合成目的蛋白的载体。,载体的选择标准,复制的起始点，能自主复制；选择标记，具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。表达载体还要有表达元件。,质粒(plasmid),特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,第二节重组DNA技术的基本原理,以质粒为载体的DNA克隆过程,一目的基因的获取,1.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)2.cDNA文库(cDNAlibrary)3.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)4.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,三目的基因与载体的连接,二克隆载体的选择和构建,1.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,2.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接单酶切末端连接双酶切末端连接,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,目录,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,EcoR切割位点,Bgl切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,目录,4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,目录,受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transformation)：重组DNA导入宿主细胞的过程。,四重组DNA导入宿主细胞,五筛选和鉴定重组体1.平板筛选2.酶切分析3.PCR分析4.核酸分子杂交分析,(插入失活法)抗药性标记选择,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,重组DNA技术操作的主要步骤,第三节LNX1基因的表达载体构建,1、查找基因序列，根据基因序列设计PCR引物,1tttcctggtctggagcgaccaatgccgtcctccttcctccaggcacctgttcaccgaagt61tgaggctggtcacaactccggcggcccaaggagctgctcggttcacccacaaggaatgag121agctgcctgcctgctgctgcttggagagccccagacagtcgcttgaagaggtgtgtggat181gtctcctagatcttgacttgctcctgaggaaatattgtgtgactgagtttcctgttatac241tgctctccaatccatcatgaaccagccagagtctgccaacgatcctgaacccctgtgtgc301agtgtgtggccaagcccactccttggaggaaaaccacttctacagctatccagaggaagt361ggatgatgacctcatctgccacatctgcctgcaggctttgctggaccccctggacactcc421gtgtggacacacctactgcaccctctgcctcaccaacttcctggtggagaaggacttctg481tcccatggaccgcaagcctctggttctgcagcactgcaagaagtccagcatcctggtcaa541caaactcctcaacaagctactggtgacctgcccattcagggagcactgcacccaggtgtt601gcagcgctgtgacctcgagcatcactttcaaaccagctgtaaaggtgcctcccactacgg661cctgaccaaagataggaagaggcgctcacaagatggctgtccagacggctgtgcgagcct721cacagccacggctccctccccagaggtttctgcagctgccaccatctccttaatgacaga781cgagcctggcctagacaaccctgcctacgtgtcctcggcagaggacgggcagccagcaat841cagcccagtggactctggccggagcaaccgaactagggcacggccctttgagagatccac901tattagaagcagatcatttaaaaaaataaatcgagctttgagtgttcttcgaaggacaaa961gagcgggagtgcagttgccaaccatgccgaccagggcagggaaaattctgaaaacaccac1021tgcccctgaagtctttccaaggttgtaccacctgattccagatggtgaaa.,2、利用设计的PCR引物和脑库cDNA模板进行PCR,3、切胶回收PCR产物，与T载体进行连接,T载体结构图,连接体系如下：载体0.5ulPCR回收产物9.5ulSolution10ul混匀后16水浴24小时连接。,4、重组T载体进行转化培养以得到大量重组质粒,TOP10感受态的制备：,挑单克隆,37度培养12小时,37度培养2-3小时,至对数生长后期OD590=0.375,冰上放置10分钟,4度下3000g离心10分钟,弃上清,CaCl210ML(0.1M,预冷）,冰上放置10-30分钟,弃上清,每50ml原培养液加入1.5ml预冷的15%的甘油和0.1M的CaCl2,50ul(100ul)分装,-80度保存,常规转化方法：即从-80冰箱取出感受态TOP10后，冰中解冻半小时，然后加入质粒，混匀后冰中半小时，在42热激90秒，冰中放5分钟，加入800ul2YT液体培养基培养20-30分钟，5000rpm离心3分钟，吸出850ul上清后混匀沉淀再涂Amp平板。37培养箱中培养12小时。,细菌培养和重组质粒的提取：1、挑取Amp平板中的单个菌落，在4ml2YT液体培养基中培养。2YT的配制：称取酵母粉3g，蛋白胨4.8g，NaCl1.5g，溶解后定溶至300ml，4ml每管分装后，120灭菌35分钟即成。2、质粒提取：一般按试剂盒说明提