第七章重组子的筛选与鉴定.ppt

基因工程原理PrinciplesofGeneticEngineering,基因工程原理,目的基因,基因载体,重组子,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,1.重组率,重组子（目的重组子）自我连接载体（非重组子）两个相互连接的载体以及两个基因片段插入的载体（非目的重组子）,2.转化率转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子。重组子中存在非目的重组子。,转化子,重组子,目的重组子,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。,重组子的筛选与鉴定,山东理工大学生命科学学院张建勇,基因工程原理,“选择”（selection）和“筛选”（screening）的基本含义,选择，是指通过某种外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。包括根据克隆载体提供的表型特征的简单选择，和根据突变的互补作用对克隆基因的直接选择。筛选则是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。,第七章重组子的筛选与鉴定,一、遗传检测法二、物理检测法三、杂交检测法四、免疫化学检测法,确定外源DNA片段是否插入并与载体连接。,一、遗传检测法,1根据载体表型特征选择重组体分子2根据插入序列表型特征选择重组体分子,1根据载体表型特征选择重组体分子,载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。根据载体分子的遗传特征进行选择，是获得重组体DNA分子细胞群体的必不可少的条件之一。(1)抗生素抗性基因插入失活选择法(2)-半乳糖苷酶显色反应选择法,(1)抗生素抗性基因插入失活选择,检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活效应(insertionalinactivation)。适用于带有抗生素抗性基因的克隆载体，将外源DNA插入到抗生素抗性基因序列内，该基因就失活。设计一套含抗生素平板，可筛选出重组子。四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)等,pBR322,特点：多种抗药标记分子量低：4363bp高拷贝多单酶切位点不影响复制,（1）四环素：,（2）氨苄青霉素抗性基因：,pBR322抗菌素标记选择,产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（3）环丝氨酸：,选择过程：,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（1）四环素抗性插入失活,无环丝氨酸培养基,1.PBR322含Ampr和tetr，具有Ampr和tetr表型。2.在tetr任何一个酶切点插入外源基因片断，都会导致tetr失活。3.转化插入外源基因的PBR322的菌液涂布于含Amp的平板上，存活者必定是转化子。（Ampr）4.将存活菌复印在含tet的琼脂板上，对照2个平板，凡在Amp平板上生长而在tet平板上不生长的菌落，必定是带有外源基因的重组子。,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。,更小的分子量和更高的拷贝数-半乳糖苷酶显色反应检测重组体具有多克隆位点,2686bp,(2)-半乳糖苷酶显色反应选择法,区分转化子与非转化子,(2)-半乳糖苷酶显色反应选择法,将pUC质粒转化的细胞培养在补加有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-靛蓝(5-bromo-4-chloro-indigo)，使菌落呈现出蓝色。外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成的-半乳糖苷酶失活效应，大肠杆菌转化子菌落在X-gal-IPTG培养基中的颜色为白色。,-半乳糖苷酶法,-半乳糖苷酶显色反应选择法,-半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,+,+,深蓝色,原理：,载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。,假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码（不破坏肽）。,选择过程,白色菌落（重组子）,蓝色菌落（非重组子）,蓝色菌落（非重组子）,-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。,（3）溶菌选择法,DNA感染E.coli发生溶菌生长，形成很亮的噬菌斑，溶源生长多少也有溶菌，挑选噬菌斑即可分析鉴定转化子。,2根据插入序列的表型特征选择重组体分子,基本原理：转化的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。例如，编码大肠杆菌生物合成基因的克隆所具有的外源DNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株的不可逆的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性，便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子,弥补缺陷,常见的营养缺陷型筛选标记：用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型,小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含DHFR的克隆才能生长,例：,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,增加新性状,二物理检测法,凝胶电泳检测法限制酶切检测法R-环检测法,1.凝胶电泳检测法,重组体在相对分子质量上会有所增加。分离质粒DNA并测定其分子长度是一种直截了当的方法。通常用比较简单的凝胶电泳进行检测。电泳法筛选比抗药性插入失活平板筛选更进了一步。有些假阳性转化菌落，如自我连接载体、缺失连接载体、未消化载体、两个相互连接的载体以及两个外源片段插入的载体等转化的菌落，用平板筛选法不能鉴别，但可以被电泳法淘汰。,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,DNA电泳检测法,分子量Marker,载体,重组克隆,如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，对于这样的阳性重组体，电泳法仍不能鉴别，只有用Southernblotting杂交，即以目的基因片段制备放射性探针和电泳筛选出的重组体DNA杂交，才能最终确定真阳性重组体。,（3）PCR扩增检测法,原理：,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,过程：,从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,用外源DNA插入片断引物作PCR。,电泳PCR产物。,检查是否有PCR产物。,PCR产物的长度是否与外源基因一致。,菌液PCR,用EP管离心收集少许菌体（菌体的量无需太多），加入适量的灭菌水重悬，沸水10min，12000rpm离心5min，用上清做模板进行PCR。94度变形可以裂解细菌，释放出DNA，所以不用提质粒也可以PCR出来条带。菌液PCR假阳性率高，建议在做过菌液PCR后，选取阳性菌株提取质粒PCR、酶切。,2.限制酶切分析法,限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法能区分重组子与非重组子，还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,酶切鉴定是必需的1.限制性图谱个体特异性,不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。2.同一载体连接不同的DNA片段，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的。3.插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切可鉴定载体及插入片段的大小，方向，切后并电泳分析，以确定是否得到预期的重组DNA。若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行序列测定。若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。,EcoRI,PBR325-APOAI,PUC19-APOAI,加样孔,2.7kb,5.4kb,0.89kb,PUC19-APCAI和PBR325-APOAI质粒PNA及其ECORI酶切产物的琼脂糖电泳图,PUC19,质粒小量快速提取加酶切鉴定,本法适用于:单酶单切点双酶双切点重组DNA转化菌落明显多于(理论应该多)载体对照组时首选。基本流程是:挑选平板转化菌落小量培养快速提取质粒。酶切DNA和载体对照电泳即可判断所选菌落是否含有重组DNA分子。,筛选过程,3.R-环检测法,临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将RNA及DNA的，RNA便会同双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而另一链处于单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体，叫做R-环结构。R-环结构十分稳定，可以在电子显微镜下观察到。可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。,三核酸杂交法,带有互补序列的DNA或RNA，其相应的同源区段就会退火形成双链结构；如果退火的核酸来自不同的有机体，形成的双链分子就被称为“杂种核酸分子”DNA/DNA杂交揭示亲缘关系的远近。DNA/RNA杂交也可用来揭示核酸片段中特定基因的位置。,核酸杂交通常采用一种带上放射性同位素或荧光标记的纯的单链DNA或RNA作为探针（probe），从一个大的未知的DNA或RNA群体中筛选到与之互补的同源DNA或RNA序列。基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。,核酸探针的来源：,目的基因的部分已克隆序列与目的基因同源性很高的已克隆的其它基因寡核苷酸探针,（一）、核酸杂交流程,通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。烘烤或紫外交联法固定DNA片段附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置。X光底片曝光，得到放射自显影图片,荧光标记法,（二）、杂交方法,原位杂交斑点杂交Southern印迹杂交（Southernblotting）Northern印迹杂交（Northernblotting）Western印迹杂交（Westernblotting）,1.原位杂交,原位杂交(insituhybridization)亦称菌落杂交或噬菌体杂交。这是因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。这种方法对于从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的菌落或噬菌斑具有特殊的实用价值。,2.斑点杂交,斑点杂交（Dotblot）：是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，一张膜上可同时检测多个样品。（1）DNA斑点杂交：先将膜在水中浸湿，再放到15SSC中。将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5l(210gDNA)。将膜烘干，密封保存备用。（2）RNA斑点杂交,3.Southern印迹杂交,两个步骤：核酸印记转移滤膜与标记的探针杂交,胶上的DNA或RNA分子，必须通过毛细管或电导作用转移到滤膜上。尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜,Southernblot筛选结果,WetElectroBlotting,Southern印迹杂交的用途,确定在克隆片段中基因编码区的大小和位置确定克隆片段在基因组中的拷贝数,4.Northern印迹杂交（Northernblotting）,Northern杂交的总体过程与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是RNA而不是DNA。Northern杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。,Northernblotting,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,通过表达蛋白进行筛选,外源DNA引入宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗原与相应的抗体发生免疫反应不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决定序列能被正确表达外源DNA可以是一个完整编码区，也可能是一个外显子，这些序列可以插入E.coli表达型载体,5.Western印迹杂交（Westernblotting）,Western杂交也与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是DNA，这种将蛋白质样品从SDS-PAGE凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为Westernblotting。其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是DNA或RNA，而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。,Westernblotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。,Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,Western装置,Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤维素膜,一抗,二抗,辣根过氧化物酶,底物,产物，并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。,Blotting过程,ImmunoBlotting,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,4种方法选择:,四免疫化学检测法及其它,直接的免疫化学检测技术，同菌落杂交技术在程度上是十分类似的。它是用抗体鉴定那引起产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。只要当一个克隆的目的基因，能够在大肠杆菌寄生细胞中实现表达，合成出外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。,免疫化学检测法可分为放射性抗体测定法（radioactiveantibodytest），和免疫沉淀测定法（immunoprecipitationtest）。这些方法最突出的优点是，它们能够检测不为寄主提供任何可选择的表型特征的克隆基因。AntibodycanbeusedasprobesLigand（配体）canalsobeusedasprobes,滤膜,+,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,1、放射性抗体检测法,抗体与产物的多种结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,125I标记的二抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,125I标记的二抗结合蛋白,125I标记的二抗,放射性抗体检测法过程,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”(白色圆圈)。,a.原理,抗原抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,b.方法,2.免疫沉淀检测法,2.免疫沉淀检测法,菌落,沉淀素,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,3.Broome-Gilbert双位点检测法,质粒基因A,插入基因B,表达,质粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,固相支持滤膜,抗A抗体,125I标记的抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,4、酶联免疫吸附测定（ELISA）,Enzyme-linkedimmunosorbantassay,（1）.原理：,一抗（primaryantibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,19,（2）.ELISA检测的一般步骤,固定样品：,将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,一抗结合：,一抗,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,二抗结合：,二抗,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,显色反应,在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。,比色,（3）.ELISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）,无细胞翻译系统,5.转译筛选法,能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。,适用于mRNA转录丰度高的外源基因。,转译筛选,mRNA,无细胞翻译系统,35S标记的甲硫氨酸,翻译,35S标记的肽链,PAGE电泳,放射自显影,比较放射性带纹的位置,载体+外源DNA,转录,与预期的产物分子量相符？,五DNA-蛋白质筛选法,DNA-蛋白质筛选法是专门设计用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法。基本操作程序是：用硝酸纤维素滤膜进行“噬菌斑转移”，使其中的蛋白质吸附在滤膜上；再将此滤膜同放射性同位素标记的含有DNA结合蛋白质编码序列的双链DNA寡核苷酸探针杂交；最后根据放射自显影的结果筛选出阳性反应克隆。,（1）凝胶阻滞试验,DNA迁移率变动试验(DNAmobilityshiftassay)，又叫凝胶