3 基因工程载体.ppt

3基因工程载体,3.1质粒载体3.2噬菌体3.3单链DNA噬菌体3.4黏粒载体3.5其他载体3.6表达载体,载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，它的本质是DNA复制子。作为载体必备的3个基本条件：I能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制II具有合适的限制性酶切位点III具有合适的选择标记基因,3.1质粒载体,质粒：染色体外能自我复制的小型DNA分子。广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中。大小1Kb-200Kb。携带基因，可以赋予宿主某些生物特性：抗生素抗性、降解复杂的有机物、产生限制酶和修饰酶等。,3.1.1质粒的一般特性,（1）质粒的分子特性（2）质粒的复制类型（3）质粒的不亲和性（4）质粒的转移性,（1）质粒的分子特性,绝大多数是双链闭合环状DNA分子。具有三种不同构型：ccDNA：闭合环状DNA，呈SC构型；ocDNA：开环DNA，呈OC构型；lDNA：线形DNA，呈L构型。,（2）质粒的复制类型,严谨型质粒：拷贝数较少，1-3个拷贝；受宿主染色体DNA复制的严格控制。松弛型质粒：拷贝数较多，10-200个拷贝，有时可达700个拷贝。,（3）质粒的不亲和性,质粒的不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同的质粒不能够在同一个宿主细胞系中稳定的共存的现象。不亲和群：将具有不亲和性的质粒划为一类，称为一个不亲和群。,（4）质粒的转移性,质粒的转移性：从一个细胞转移到另一个细胞的特性。根据质粒是否带有控制细菌配对和质粒接合转移的基因，可分为：,接合型质粒：F因子；多属于严谨型质粒。非接合型质粒：如ColE1质粒；用于基因工程。质粒的迁移作用：由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移。,3.1.2理想质粒载体的必备条件,具有较小的分子量和较高的拷贝数；具有若干限制性内切酶的单一酶切位点；MCS：多克隆位点具有两种以上的选择标记基因；缺失mob基因插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。,3.1.3质粒载体的构建,pBR322的构建步骤,3.1.4常用的质粒载体类型,(1)克隆质粒载体(2)表达质粒载体(3)多功能质粒载体(4)穿梭质粒载体,(1)克隆质粒载体,用于基因或DNA片段无性繁殖。目前常用的克隆质粒载体有：pBR322、pUC、及其派生质粒。,互补,LacZM15,LacZ,蓝色产物,X-gal,IPTG,pUC比pBR22更理想,更小的分子量；利用组织化学法筛选重组体，方便省时；具有多克隆位点；拷贝数更多。,(2)表达质粒载体,表达载体：专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。表达质粒载体的特点：具有强启动子；具有核糖体结合位点（S-D序列）；具有转录终止序列。,(3)多功能质粒载体,具有多种功能，可以根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。如pGEM系列质粒。,(4)穿梭质粒载体,穿梭质粒载体：由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。常见的穿梭载体：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体、,3.2噬菌体,感染,环化,转折点,整合,复制,形成子代,溶菌,细胞分裂,紫外线照射,复制,3.2.1噬菌体的生活周期：溶源途径和裂解途径的选择,噬菌体的基因组,调节区重组区复制区结构基因,非必需区：基因J与基因N之间的DNA区段。,3.2.2噬菌体载体的构建,野生噬菌体不适合做载体：基因组大而复杂，含有常用限制酶的多个识别位点；噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNA分子。对噬菌体的改造以满足基因工程需要：切除掉非必需区段，扩大载体容量；除去多余的限制酶识别位点；引入适当的选择标记，以方便筛选；通过在某些必需基因引入无义突变使之称为安全载体。,3.2.3常用的噬菌体载体,噬菌体载体的分类：插入型载体：具有一个限制酶的识别位点供外源DNA插入。容量一般在10Kb之内。半乳糖苷酶失活：gt11、gt1823、Charon2.免疫功能失活：gt10、NM1149、Charon6、Charon7.ZAP插入型载体。替代型载体：具有两个限制酶识别位点，它们之间的DNA区段可被外源DNA取代。容量为20Kb。Charon系列：Charon3235、Charon40、Charon21A.EMBL系列：EMBL3、EMBL4、EMBL3A.Spi-正选择取代型：L47、2001、EMBL.,ZAP插入型载体,3.3M13噬菌体,丝状大肠杆菌噬菌体：M13、f1、fd。DNA为单链环状,大小6.4Kb。M13、f1、fd的DNA同源性较高。编码10个基因。含有少量间隔区：2和5之间，3和7之间。,3.3.1M13噬菌体的生活史,3.3.2M13噬菌体载体,优越性：不存在包装限制问题；可产生大量含有外源DNA的单链DNA分子；可以测定外源DNA片段的插入方向；也可以制备双链的复制型DNA；两种形式的DNA都能侵染大肠杆菌。,3.3.3M13噬菌体载体的用途,利用成对的载体克隆，外源DNA能按彼此相反的取向插入到载体上，有利于测序；制备DNA探针；基因定点突变。,3.3.4噬菌粒载体,M13噬菌体载体的不足：插入外源片段不稳定，片段越大越容易发生缺失或重排，最大克隆能力为1.5Kb理论上片段插入有两种方向，其实总是按一种主要的方向插入。噬菌粒载体汇集了质粒和丝状噬菌体载体的优点：分子较小，约3Kb，克隆能力为10Kb；既含有质粒复制起点也含有丝状噬菌体复制起点；具有多种功能：DNA片段克隆、定点突变、测序、体外转录和翻译。,pUC119,3.4黏粒载体,又称柯斯质粒载体；具有更高的克隆能力：35-45Kb；含有噬菌体的cos位点及一些相关蛋白，能够环化、体外包装及高效感染；具有质粒载体的易操作、选择及高拷贝数等特性；具有与同源序列的质粒进行重组的能力。,黏粒载体的应用,黏粒克隆：应用黏粒载体克隆真核基因组大片段的技术。插入片段两端插入T3和T7噬菌体RNA聚合酶启动子，可以体外转录，制备RNA探针。插入真核细胞病毒复制起点及相关选择标记