原核表达实验PPT演示课件

实验一：大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达,生命科学技术学院2010年6月,1,黑曲霉的优化培养,总DNA或RNA的抽提,PCR或RT-PCR扩增xynB基因,目的基因的TA克隆,质粒pMD-xylB,EcoRI+XhoI双酶切,凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB,乙醇沉淀回收线性化片断,大肠杆菌表达载体pET-28(a)+,酶连,酶连产物转化E.coliDH5,挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证),2,3,4,5,IPTG100mM使用浓度0.1mMKan100mg/ml使用浓度50g/mlPBS缓冲液：137mMNaCl2.7mMKCl10mMNa2HPO410mMKH2PO4,试剂及缓冲液：,6,3SDS缓冲液：187.5mMTris-HCl(pH6.8,25)6%w/vSDS30%甘油0.03%w/v溴酚蓝GelStainingBuffer(每100ml):考马斯亮蓝250mg甲醇45ml乙酸10ml水45mlGelDestainingBuffer:甲醇100ml乙酸100ml加水至1000ml,7,SDS-PAGE胶：30%聚丙烯酰胺10%SDS1.5MTris-HClpH8.80.5MTris-HClpH6.810%过硫酸铵（现配）TEMED,Tris-甘氨酸电泳缓冲液,25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸（电泳级）（PH8.3）0.1%SDS可配成5贮存液备用，在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml10%（w/v）的电泳级SDA贮存液，用去离子水补至1000ml。,8,操作步骤1：（小规模诱导-筛选正确表达克隆子）,1、从平板上挑取1个pET28-xylB/BL21转化子接种于装有2mlLB/Kan（Kan浓度50ug/ml）培养基的PA瓶中，37oC，250rpm，培养过夜；2、取过夜培养物按1%接种量分别转接二个装有2mlLB/Kan的PA瓶中，37培养约2小时40分钟；3、培养结束后，分别向其中一个瓶加入IPTG（终浓度0.1mM）并标记为“+I”，另一瓶不加IPTG标记为“-I”，28培养，250rpm，约4小时后收集菌体；4、从“+I”、“-I”培养瓶中各吸取1ml菌液于两个标有“+I”、“-I”的1.5ml离心管中,离心收集菌体,10000rpm、RT、1分钟，去上清，加入80ul缓冲液和40ul3SDS上样缓冲液悬浮菌体，-20保存备用。,9,5、取前面保存菌体（加入1SDS上样缓冲液），置沸水5分钟（破细胞），然后置室温；6、在室温以10000rpm离心1分钟，取上清10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳检测。附：SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳：,10,12%分离胶配制(5ml):水1.6ml30%聚丙烯酰胺2ml1.5MTris-HCl(pH8.8)1.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED0.002ml,制备SDS-PAGE胶,分离胶配制时，过硫酸铵和TEMED先不加，将制胶板跟电泳槽装配好，制胶板凹面朝向自己方便注胶，然后加入过硫酸铵和TEMED，将胶液混合均匀后注入制胶板中，再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置30分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。,11,5%积层胶配制(2ml):水1.4ml30%聚丙烯酰胺0.33ml0.5MTris-HCl(pH6.8)0.25ml10%SDS0.02ml10%过硫酸铵0.02mlTEMED0.002ml,积层胶制作方法跟分离胶制作相似，混合均匀后注入胶板，缓慢的插入梳子，静置30分钟，胶凝固后取出胶板，撕掉胶条，拔去梳子，再将胶板凹面背向自己装好电泳槽。缓慢向内槽倒入Tris-甘氨酸电泳液，使其没过凹槽，向外槽倒入与内槽持平的电泳液。,12,点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20ul。点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到120伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色30-45分钟。染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，前面几次可以时间较短，第一次约10分钟，依次时间稍微延长，最后一次可以过夜脱色。,蛋白质电泳,13,1、挑取1个正确表达目标蛋白的转化子接种于装有2mlLB/Kan（Kan浓度50ug/ml）培养基的PA瓶中，37oC培养过夜；2、按1%接种量接种于50mlLB/Kan（Kan浓度50ug/ml）中37培养约2小时40分钟，OD600=0.4-0.6；（前两步与操作步骤1相同）3、培养完毕后，向三角瓶中加入IPTG（100mM）50l，使培养液中IPTG终浓度为0.1mM；28诱导培养，250rpm，约4小时后收集菌体；4、吸菌液1ml于1.5ml离心管中，另取20ml倒入50ml离心管中,离心收集菌体,6000rpm，4,10分钟去除培养基，加入2ml1PBS缓冲液悬浮菌体，然后分装于2个1.5ml离心管中，10000rpm，离心2分钟，去上清，-20保存备用。,操作步骤2：（大规模诱导-大量表达目标蛋白）,14,实验二：大肠杆菌细胞破碎及蛋白浓度测定,15,1、取出保存的诱导后的细胞（10ml），在冰上缓慢融化后，加入1mlPBS缓冲液；2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液中，开始超声，10sec/次，间歇15sec（避免过度产热），重复数次（一般5-6次）直至溶液变清亮；所有过程均需在冰上进行；3、在4、13000rpm离心20分钟，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；4、取上清液于另一干净的1.5ml离心管中，取40l上清液测定总蛋白的浓度。,16,采用BSA法测定蛋白浓度（Bradford,1972），首先作好标准曲线，然后将样品测得的OD在标准曲线上比较后获得样品蛋白质浓度。,方法：1、完全溶解BSA蛋白标准品(5mg/ml)，用PBS将标准品稀释成100-500g/ml的溶液2、分别取40L的不同浓度的溶液加入到1mL考马斯亮蓝试剂中，摇匀，室温反应3-5min后，在595nm处测定光吸收值。3、以光吸收值为横坐标，标准蛋白含量为纵坐标，绘制标准曲线。,17,蛋白浓度标准曲线的绘制,18,1、取出保存的诱导后的细胞（10ml），在冰上缓慢融化后，加入1mlPBS缓冲液；2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液中，开始超声，10sec/次，间歇15sec（避免过度产热），重复数次（一般5-6次）直至溶液变清亮；所有过程均需在冰上进行；3、在4、13000rpm离心20分钟，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；,实验三：表达蛋白的纯化,19,4、细胞破碎上清液中，加入Ni-NTA树脂柱，在4下结合1h，每5分钟摇动一次；然后5000r/min离心1min移除上清液；5、加入10mmol/L咪唑(imidazole)，50mmol/LpH7.5磷酸缓冲液(PBSbuffer)，在4条件下洗涤30min，弃上清；重复洗涤3次，保留Ni-NTA柱；6、加入250l100mmol/L咪唑(imidazole)、50mmol/LpH7.5磷酸缓冲液(PBSbuffer)洗脱液，在4条件下洗涤30min后5000r/min离心1min，用移液器小心收集上清（应尽量避免吸到离心管底部的Ni-NTA柱），置于新的1.5ml离心管中，-20贮存备用。,20,实验四：表达蛋白的鉴定-western杂交,21,操作步骤1蛋白质电泳,取-20保存的纯化好的蛋白样品（洗脱收集的上清）50l，用PBS十倍稀释；取50l稀释液，加入25l3SDS上样缓冲液，沸水水浴5分钟；领取一管（每块胶）GST蛋白样品作为阴性对照领取一管（每块胶）xylB蛋白样品作为阳性对照各样品在室温以10000rpm离心1分钟，取上清10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳。,22,操作步骤2蛋白质的半干式电转移,（戴手套操作）将蛋白胶的积层胶切除(当胶上的样品较少时，不含目的蛋白的胶应都切除，使剩下的胶块尽可能小)，然后浸入Towbinbuffer中平衡；预先准备专用的滤片2张(或18张滤纸)和1张硝酸纤维素滤膜，其大小都应与凝胶大小吻合；用铅笔在滤膜一角做好标记；将1张滤片(或9张滤纸)在Towbinbuffer中浸润后放置在电极上(如用9张滤纸则应逐张叠放整齐)，用玻璃棒挤出所有气泡。（具体摆放顺序见下图）,23,于Towbinbuffer中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸/片上，排出气泡；然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上，排出气泡；再依次将另外9张滤纸(1张滤片)在Towbinbuffer中浸润后放置在蛋白胶上。加上阴极电板，25V电压转移40分钟。转移完成后，取出NC膜，在TBS漂洗5min，置入丽春红染液中染色，出现蛋白条带后，用自来水漂洗1min，用铅笔标记处蛋白质Marker的位置，然后加入TBS漂洗至颜色消失；,24,9层滤纸电转缓冲液,9层滤纸电转缓冲液,阳极(+),阴极(-),Trans-BlotSDwithGelSandwich,25,操作步骤3膜的封闭,用含有5脱脂牛奶的TBS-T封闭NC膜（含有0.1%吐温20的1倍的TBS），在室温条件下孵育1至2小时(推荐在4条件下孵育过夜)；用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。,26,在室温条件下，将NC膜转入含有1脱脂牛奶和合适稀释度的一抗的TBS-T溶液中（1:1000），孵育1至2小时；用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。,操作步骤4一抗杂交,27,操作步骤5二抗进行杂交,在室温条件下，将NC膜转入含有1脱脂牛奶和合适稀释度的二抗的TBS-T溶液中(1:5000)，孵育1小时；用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，3次。用TBS漂洗：5分钟，3次,28,操作步骤6DAB（3,3二氨基联苯二胺）显色检测,加适量显色液至将膜浸没，观察，出现清晰的条带（最多5分钟）即可加入蒸馏水终止反应。,29,TowbinBuffer：25mMTrispH8.3192mMglycine20%methanol10TBS缓冲溶液（1L）Tris-Base24.2g，NaCl80g，pH7.6,显色液(10ml)：DAB6mg0.01MTris-HCl(pH7.6)9ml0.3%CoCl21ml30%H2O210ul,缓冲液配方：,30,第一组，第二组，第三组，第四组配YPD液体培养基3L葡萄糖20g，酵母提取物10g，蛋白胨20g，pH6.5定容至1L分装20ml/250ml三角瓶，75瓶200ml/500ml三角瓶，7瓶第五组，第六组，第七组，第八组配BMMY液体培养基4L酵母提取物10g，蛋白胨20g，酵母氮碱3.4g，硫酸铵10g，用pH7.0的0.1M的磷酸钾缓冲液定容至1L。（pH7.00.1mol/L磷酸钾缓冲液：1mol/LK2HPO461.5ml，1mol/LKH2PO438.5ml，定容至1L，调节pH，定容至1L）分装50ml/250ml三角瓶，75瓶第九组，第十组，第十一组PA瓶100个，50ml离心管100个，洗好包好，灭菌250ml三角瓶200个洗好500ml三角瓶50个，试剂瓶20个洗好,31,第十二组，第十三组，第十四组配LB液体培养基6L胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0定容至1L分装50ml/250ml三角瓶，40瓶200ml/500ml三角瓶，20瓶第十五组配置10%SDS（w/v）500mlTris-甘氨酸电泳缓冲液:配成5贮存液备用，在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml10%（w/v）的电泳级SDS贮存液，用去离子水补至1000ml。染色液GelStainingBuffer1L考马斯亮蓝2.5g，甲醇450