T-A克隆原理PPT演示课件

刘明伟MingweiLiuE-Mail:lmingweiWebsite:2011.11,小鼠Beta-actin基因片段T-A克隆及鉴定,1,1、小鼠DNA基因组提取,实验目的：材料：小白鼠肝试剂：DNA提取试剂盒器材：托盘（1个）、手术剪（3把，1大2小）、镊子（2个）、EP管（12个）、研磨棒（12支）、生理盐水、加样器、吸头（500ul4盒；100ul1盒）、废液瓶（4个）、量筒（100ml1个）、PE手套（1包）仪器：微量高速离心机（1台）、65水浴箱（1台）、微量紫外分光光度计（1支）分组：分8个小组,2,实验准备,1）小白鼠准备；2）DNA提取试剂盒准备（用前离心至底部）；SolutionA、SolutionB复温溶解（若有沉淀）；RinseB加无水乙醇56ml混匀；SolutionC制备：SolutionC原液1.1ml+丙醇68.75ml+异丁醇41.25ml加入SolutionC空瓶中混匀，4保存;ElutionBuffer：65水浴；3）开水浴箱，设65,3,DNA提取操作步骤,戴手套，杀小鼠，取其肝（抓住小鼠尾巴，将小鼠旋晕，用手术剪剖开小鼠腹部，取其肝，约20mg，绿豆大小），将肝组织放入EP管（规格：1.5ml）中，加SolutionA（350ul）+RNaseA1（0.9ul，非RinseA）（二者可混匀后使用），快速研磨成糊状；将研磨液体转移至CollectionTube中，并再取SolutionA（350ul）冲洗研磨棒及EP管，混匀，水浴（65，5min）；加入SolutionB（400ul），混匀，加入SolutionC（4，1ml），再混匀，离心（12000rpm，2min）；弃上层有机相，加SolutionC（4，1ml），混匀，离心（12000rpm，2min）；,注：查看提取试剂盒说明书,4,弃上层有机相，将下层水相液转移至FilterCup（套CollectionTube）中，离心（12000rpm，1min）；弃FilterCup，得滤液，在其中加入DBBuffer（400ul），混匀后转移至SpinColumn（套CollectionTube）中，离心（12000rpm，1min），弃滤液；沿四壁往SpinColumn中加入RinseA（500ul），离心（12000rpm，30sec）后弃滤液；再沿其四壁加入RinseB（事先已混加无水乙醇，500ul），离心（12000rpm，30sec）后弃滤液；重复加RinseB及离心一次，再弃去滤液；,注：上面步骤5，6，7中的CollectionTube弃去废液后可重复使用，以节约！,5,在SpinColumn（下套新CollectionTube）膜中央（不沾壁），加ElutionBuffer（65，50200ul），静置1min后离心（12000rpm，30sec）；得DNA混合溶液，采用微量紫外分光光度计定量（浓度和OD260/OD280），-20保存。,注意：1）操作带手套2）各组尽量步调一致，减少排队等离心的时间,高质量DNA:OD260/OD280=1.8,OD260/OD2302.0OD260/OD2801.9RNA污染OD260/OD2302.0OD260/OD2802.0被异硫氰酸胍等污染OD260/OD2302.0小分子及盐存在。,6,2、小鼠DNA基因组PCR扩增、纯化与鉴定,实验目的：材料：上次实验提取DNA试剂：RCR扩增试剂盒（用前离心至底部）；0.5TBE电泳缓冲液、琼脂糖、6上样buffer、Gold-viewer染料、DNAMarker；器材：PCR管（2盒）、3种型号吸头（100ul、20ul、10ul）、去离子水仪器：Bio-radPCR扩增仪、微量光度计、60水浴箱、微量高速离心机、制冰机、电泳槽、微波炉、电泳仪,7,实验前准备,灭菌：Tip枪头、PCR管及去离子水引物溶液：稀释（20uM），即上引物4.65nmol加236ul去离子水；下引物5.03nmol加252ul去离子水（加水前，注意肝分管离心）；制冰和PCR管临时存放泡沫；纯化试剂盒准备：DBBuffer：复温溶解（如有沉淀）RinseB：加56ml无水乙醇,8,PCR操作步骤,配置反应体系：上引物1（20uM）1ul下引物2（20uM）1ul模板0.11ug（0.2ug/0.4ug4ul）PremixTaq25ul加灭菌去离子水至50ul注意：PremixTaq已经混合dNTP、Taq酶、PCRbuffer、Mg2+（见说明书）；各组注意编号轻度涡旋混匀，瞬时（10sec)离心放入PCR扩增仪中；设置反应程序并运行程序：,注意：仪器参数中的hot-lead和BOLK差异：hot-lead，热盖之意，主要适用于反应体系较大（如100ul），仪器加热套管不能使PCR管内反应溶液上部和下部受热均匀（若反应溶液体系上下部受热不均，会造成体系内反应过程温度升降不一致；BLOCK则适合于小体系（50ul以下），加热套管足以维持PCR管内反应体系受热均匀。,9,PCR仪器运行期间，制作1.2%琼脂糖凝胶（40ul）称0.48g琼脂糖加入0.5TBE（40ul三角瓶），轻摇混匀，后置于微波炉中，低火缓慢加入融化。如有结块，可取出轻摇后再加热。待其完全融化透明，无块状琼脂，且温度稍高于手温时（加入Glodview2ul）倒入制胶槽中。注意：防止高温加热琼脂糖溢出；倒胶前插入梳子；倒胶时注意缓慢，防止起泡产生。,实验中准备,10,取出PCR反应管，加DBBuffer（150ul），混匀；将混合溶液转移至SpinColumn（套CollectionTube）中，离心（12000rpm，1min）得滤液；将此滤液再次转移至上面的SpinColumn（需另套CollectionTube）中，离心（12000rpm，1min），弃滤液；在SpinColumn（套CollectionTube）中RinseA（500ul），离心（12000rpm，30sec）弃滤液；,PCR产物纯化步骤,注：上面步骤5，6，7中的CollectionTube弃去废液后可重复使用，以节约！,11,在SpinColumn（套CollectionTube）加RinseB（700ul），离心（12000rpm，30sec）弃滤液；重复一次本次操作；在SpinColumn（另套新CollectionTube）膜中央处加ElutionBuffer（2530ul，60），静置1min后离心（12000rpm，30sec）得PCR纯化溶液采用微量紫外分光光度计定量（浓度和OD260/OD280）；取5ul，与上样buffer（2ul）混合后点样（需同时点上DNAMarker），电泳鉴定扩增效果：电泳条件：150V，30-50min,注：查看PCR产物纯化试剂盒说明书,12,3、小鼠DNAPCR扩增片段重组,实验目的：材料：PCR纯化产物、感受态细胞DH5（大肠杆菌）试剂：pMD19-TVector连接试剂盒（用前离心至底部）；2%的X-Gal：用二甲基酰胺溶解，-20保存20%的IPTG：0.4g的IPTG溶于2ml水中，0.22um过滤，-20保存100mg/ml的Amp：0.2g的Amp溶于2ml水中，0.22um过滤，-20保存LB液体培养基：Amp-LB固体平板：LB液体培养基500ml+琼脂糖7.5g高压灭菌，冷前加AMP1ml，随后倒板器材：低温水浴箱（PCR仪）、空气浴摇床、42水浴箱、培养箱、微量高速离心机、制冰机耗材：L棒、酒精灯,13,实验前准备,灭菌：Tip枪头、平板、5ml离心管、PCR管、EP管、LB液体培养基、LB固体培养基制冰连接试剂盒准备：,实验中准备,进行连接转化过程中，将灭菌好的固体培养基用微波炉低温档加热融化，待与手温相近时，加入AMP（2ul/20ml)，倒入平板（厚度控制2-3cm），当其凝固后加X-Gal（40ul）+IPTG（4ul）混合涂布于表面待用。,14,连接与转化步骤,取PCR产物扩增和纯化效果最好的产物在PCR管中进行如下操作：配制连接体系，混匀后，进行连接反应（16，30min，可在PCR仪中进行）；,感受态细胞1支（100ul）取出置于冰上，加入10ul上述连接混合液，置30min；随即置水浴（42，45sec），后取出冰浴1min；取出加LB液体培养基（890ul），摇床培养（37，20-60min）100ul培养菌液涂布于事先处理好的LB固体培养基上培养（37过夜，中途注意翻平板）。,15,4、小鼠重组DNA菌株筛选及培养,试剂：Amp-LB液体培养基耗材：酒精灯仪器：空气浴摇床,实验准备：消毒对象：培养瓶/培养管（带塞子）、Amp-LB液体培养基,操作步骤：挑选白色单菌落，接种至Amp-LB液体培养基（4ml）中，37摇床培养过夜。,16,5、小鼠重组DNA质粒提取、酶切及鉴定,实验目的：材料：上次培养菌液试剂：质粒提取试剂盒（用前离心至底部）；0.5TBE电泳缓冲液、琼脂糖、6上样buffer、核酸染料、200型DNAMaker器材：加样器、吸头、洗头盒、EP管、废液瓶、PE手套仪器：微量高速离心机、紫外观测仪，电泳仪，电泳槽、微波炉、37水浴箱、60水浴箱,17,实验前准备,将RNaseA1浑浊液全部加入到SolutionI，混匀，4保存SolutionII37复温溶解（若有沉淀，否则，提取过程菌体可能不能聚集成块）RinseB加入56ml无水乙醇制作1.2%的琼脂糖凝胶,18,取培养菌液（1ml）于EP管中，离心（12000rpm，2min），弃上清；随即加入SolutionI（含RNaseA1，250ul），充分悬浮细菌沉淀（用移液枪吹打）；加入SolutionII（250ul）翻转混匀（5次，不超过5min，目的：使细胞充分裂解）；加入SolutionIII（4，400ul）翻转混匀（5次，成凝集块），静置2min后离心（12000rpm，10min）取上清液；将上清液转移至SpinColumn（套CollectionTube）中，离心（12000rpm，1min）弃滤液；,操作步骤,1）质粒DNA提取,19,加RinseA（500ul）入SpinColumn（套CollectionTube）中，离心（12000rpm，30sec）弃滤液；加RinseB（700ul）入SpinColumn（套CollectionTube）中，离心（12000rpm，30sec）弃滤液；重复本步操作；加ElutionBuffer（60ul，60）至SpinColumn（套新CollectionTube）新膜中央，静置1min后离心（12000rpm，1min）得质粒DNA；,注：上面步骤5，6，7中的CollectionTube弃去废液后可重复使用，以节约！,20,2）质粒DNA酶切,在PCR管中配置如下酶切体系：,混匀后，37水浴，1h,NEBuffer4因不同公司生产，而名称不同,21,3）质粒DNA酶切片段电泳,取5ul，与上样buffer（2ul）混合后点样（需同时点上DNAMarker），电泳鉴定（紫外观察）酶切结果。电泳条件：150V，30-50min,点样孔,3000bp,2400bp,2000bp,1800bp,1600bp,1200bp,400bp,600bp,800bp,1000bp,1400bp,Beta-actinGenefragment,pMD19-T,22,本实验原理,T-A克隆重组：是简单的PCR产物直接重组方法。,原理：TaqDNA聚合酶（具有有末端连接酶活性）在扩增目的基因片段时，可不依赖其模板，可在PCR产物两端（3）自动加上碱基（尤其优先加上A）。为此，在T4DNA连接酶催化下，实现质粒载体（载体酶切切口具有游离T）和PCR产物的直接连接，实现DNA片段重组。该法已广泛应用，如商品化载体如pGEM-T,23,pMD19-TVector,EcoRV酶切,连接液SolutionI中包含EcoRV限制性酶及T4连接酶,大肠杆菌感受态细胞,24,改造,在Xba1与Scal1之间引入EcoRV酶切位点,MCS:多酶切位点/多克隆位点,25,pMD19-TVector,EcoRV,26,-互补筛选（蓝白色菌落筛选）,原理：pMD19-T质粒载体中具有LacZ（N）短区段，编码-半糖苷酶N端146个AA（也称-多肽），其前面的Plac可以启动LacZ（N）的转录和表达，但通常受抑制，在IPTG作用下，该抑制可去除；受体菌大肠杆菌具有LacZ（C）短区段，可编码-半乳糖苷酶C端部分；-互补：当pMD19-T质粒载体转入相应大肠杆菌受体细胞中，LacZ（