12第五章 噬菌体载体PPT演示课件

第五章噬菌体载体和柯斯载体,第一节噬菌体的一般生物学特性第二节噬菌体载体第三节柯斯质粒载体第四节单链DNA噬菌体载体第五节噬菌粒载体克隆外源DNA的能力：*质粒：15kb左右；*噬菌体：25kb左右；*柯斯载体：45kb左右。,(240页),1,基因工程又称重组DNA技术其实施至少要有四个必要的条件1.工具酶2.基因3.载体4.受体细胞（基因工程.静国忠，85页）,2,3,噬菌体定义：是一类细菌病毒的总称。噬菌体与质粒的区别*质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分子。*噬菌体：DNA分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。,(240页),4,噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。,5,第一节噬菌体的一般生物学特性,噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。1.噬菌体的结构及其核酸类型：*一般分为三种类型：无尾部结构的二十面体型。具尾部结构的二十面体型。线状体型。*大多数噬菌体都属于第二种类型。,(240页),6,(241页),7,8,1.噬菌体的结构及其核酸类型：噬菌体的核酸：最常见的是：双链线性DNA。还有双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。有些噬菌体DNA碱基不是由标准的A、T、C、G四种碱基组成。如T4噬菌体DNA中没有C，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）。,(240页),9,1.噬菌体的结构及其核酸类型：常用作基因工程的噬菌体：双链噬菌体：噬菌体。*野生型噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。*目前常用的有：EMBL系列、gt系列、Charon系列。单链噬菌体：M13噬菌体。,(刘志国，102-105页）,10,2.噬菌体的感染性,一个噬菌体颗粒感染一个细菌细胞迅速形成数百个子代噬菌体颗粒每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞再产生出数百个子代颗粒。如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。噬菌斑：感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。菌苔（lawn）：覆盖培养基表面的单层细菌。(英含遗工词),(241页),11,2.噬菌体的感染性,将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之前，将此培养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内，头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期。此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大量的噬菌斑。,(241页),12,2.噬菌体的感染性,噬菌体对寄主细胞的感染作用：烈性噬菌体的生命周期：噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上DNA注入到被感染的细菌细胞噬菌体DNA复制合成出新的头部及尾部蛋白质组装成子代噬菌体颗粒寄主细胞壁被破坏并发生溶菌释放出子代噬菌体颗粒,(241页),13,234页,噬菌体：细菌病毒。烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命周期的噬菌体。溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA。溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体的细菌。噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解而形成的空斑。,14,3.噬菌体的溶菌生命周期,噬菌体的生命周期分为：溶菌周期。溶源周期。两种类型的噬菌体：烈性噬菌体：只有溶菌周期。温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。,(242页),15,3.噬菌体的溶菌生命周期,基本过程为：（1）吸附：噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。（2）注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。（3）转变：被感染的细菌成为制造噬菌体颗粒的场所。（4）合成：功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋白质。（5）组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。（6）释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。,(242页),16,(242页),17,4.噬菌体的溶源生命周期,温和噬菌体感染寄主细胞之后出现的溶源周期中，不会产生出子代噬菌体颗粒，寄主的细菌细胞仍然存活着并继续进行细胞分裂。经过了许多世代之后，如果环境条件正常的话，溶源周期便会终止，重新开始溶菌生命周期。寄主细菌会因裂解而致死，释放出许多子代噬菌体颗粒。,(243页),18,234页,噬菌体：细菌病毒。烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命周期的噬菌体。溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA。溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体的细菌。噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解而形成的空斑。,、若干基本概念,19,4.噬菌体的溶源生命周期,、溶源周期的主要特征（以噬菌体为原型）：（1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。（2）经过短暂的转录。（3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。（4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。,(243页),20,(244页),21,4.噬菌体的溶源生命周期,另一种类型的溶源周期是以噬菌体T1为原型。比较少见。基本特征是：不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。,(244页),22,4.噬菌体的溶源生命周期,、超感染免疫性：溶源性细菌有两个重要特点：（1）超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免疫性。（2）溶源性细菌的诱发：经过许多世代之后，溶源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。,(245页),23,5.重组噬菌体的分离,外源DNA片段+噬菌体DNA分子重组的噬菌体DNA分子感染寄主细胞用32P标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交获得阳性克隆分离大量的重组体噬菌体DNA，实现克隆基因的扩增,(247页),24,5.重组噬菌体的分离,接种针粘取噬菌体颗粒新鲜的细菌培养基中在细胞内大量增殖氯化铯密度梯度离心（噬菌体介于纯DNA与纯蛋白质之间）纯化重组体噬菌体DNA,(247页),25,(248页),26,第二节噬菌体载体,噬菌体：*分子量为31x106dal。*中等大小的温和噬菌体。*已定位的基因至少有61个。一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影响噬菌体的生命功能。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶源状态，或处于溶菌状态。（张)DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。(张),(248页),27,噬菌体：,作为基因克隆载体的一个重要特性：由外源基因取代非必要基因所形成的重组噬菌体DNA，可以随着寄主大肠杆菌细胞一道复制和增殖，而且在其溶源周期中，它们的DNA是整合在大肠杆菌的染色体DNA上，成为后者的一个组成部分。,(249页),28,1.噬菌体的分子生物学概述,（1）基因组的结构：碱基对数：48502。cos位点：线性双链DNA分子的两端各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即粘性末端。注入到感染寄主细胞内的噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5-P和3-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。由这种粘性末端结合形成的双链区称为cos位点。cos位点：噬菌体线性双链DNA分子的两端各12个完全互补的核苷酸粘性末端结合形成的双链区。（在包装进蛋白质外壳之前，DNA在cos位点切开成线性）,(249页),29,(250页),30,噬菌体基因组的三个区域,左侧区：包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。中间区：又称为非必要区。包括与重组以及使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的int基因，和把原噬菌体从寄主染色体上删除下来的xis基因。右侧区：包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因以及溶菌基因。,(249页),31,(250页),32,（2）噬菌体DNA的复制在噬菌体感染的早期，环形的DNA分子按形式从双向进行复制。到了晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出由一系列线性排列的基因组DNA组成的长多连体分子。多连体分子经过核酸酶的切割作用，从cos位点将它分离成单体分子之后，才能够包装。,(251页),33,在电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域如一只眼睛（张玉静，101）,34,（张玉静，141）,35,（张玉静，141）,36,2.噬菌体载体的构建及其主要类型,（1）构建的基本原理：野生型噬菌体DNA，一种酶的酶切位点多。不适合作基因克隆的载体。基本原理：删除多余限制位点。构建的噬菌体的派生载体：*插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。也有一些具有两个克隆位点，但彼此靠近。*替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。,(253页),37,插入型载体：只能承受较小分子量(一般在10kb以内)的外源DNA片段的插入，广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。替换型载体：可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生物的染色体。,(255页),38,（2）噬菌体载体的主要类型、插入型载体：插入失活效应：外源的DNA克隆到插入型的噬菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力。免疫功能失活的插入型载体：在基因组的免疫区中插入外源DNA片段，载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。只能形成清晰的噬菌斑。*有外源DNA插入：清晰的噬菌斑。*没有外源DNA插入：亲本噬菌体可以进入溶源状态，形成浑浊的噬菌斑。-半乳糖苷酶失活的插入型载体：（下页）,(255页),39,-半乳糖苷酶失活的插入型载体：,这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中有编码-半乳糖苷酶的基因lacZ。这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么由这种重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。如使用大肠杆菌Lac+指示菌，无论有无外源DNA插入，都形成蓝色噬菌斑。可以应用Xgal-IPTG显色技术检测转化子。,(256页),40,具有功能活性的-半乳糖苷酶是四聚体。Xgal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)：无色化合物。-半乳糖苷酶能将无色的Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯靛蓝。因此，Xgal可作为检测-半乳糖苷酶的一种指示剂。IPTG：一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成-半乳糖苷酶。称IPTG为-半乳糖苷酶的安慰诱导物。乳糖诱导物IPTG（372页）,Xgal-IPTG显色反应（285页）,41,(257页),42,、替换型载体,又叫取代型载体。在其中央部分有一个可以被外源DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。安排在中间可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复排列，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。,(256页),43,(257页),44,、替换型载体,例子：M.Thomas等人（1974）发展的gtc，可处于稳定的溶源状态，产生浑浊型的噬菌斑。可取代部分被取代之后，不能进入溶源状态，形成清晰型的噬菌斑。,(256页),45,用替换型载体克隆外源DNA片段包括三个步骤,第一：应用适当的核酸内切限制酶消化载体，除去基因组中可取代的DNA区段。第二：将所得的DNA臂同外源DNA片段连接。第三：对重组的DNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体。,(258页),46,（3）凯伦噬菌体载体,有插入型（如凯伦2）、替换型（如凯伦30）。基本都含有-半乳糖苷酶基因。使用凯伦载体的一般程序：用限制酶酶切载体产生左臂、中央区段、右臂，并分离两臂与外源DNA连接包装成具感染能力的噬菌体颗粒涂布在敏感细菌平板上（含有Xgal）有外源DNA插入的噬菌体，形成无色噬菌斑，没有插入的噬菌体，形成蓝色噬菌斑,47,(253页),48,3.噬菌体的改良,Spi+表型的噬菌体：野生型噬菌体有red和gam基因。不能在P2噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为Spi+（sensitiveofP2inhibition）。即对P2噬菌体的抑制作用呈敏感反应。Spi-表型的噬菌体：噬菌体丧失掉了red和gam基因，例如被外源DNA所取代，这样的噬菌体则获得了Spi-的表型，能够在噬菌体P2溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌斑。在应用具有red和gam基因的替换型载体作基因克隆实验中，可以按照Spi特性来选择重组体。Sp-表型提供了一个正选择记号。,(260页),49,噬菌体的体外包装（1）重组体DNA分子的转染作用,应用DNA重组技术，把带有目的基因的外源DNA插入到载体之后，还要将这些重组DNA分子导入寄主细胞。应用体外包装技术，把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒，从而能够按照正常的噬菌体感染过程导入寄主细胞。结果明显地提高了重组体DNA的转染效率，可达107左右。（每微克DNA转染产生的噬菌斑数目）,(266页),50,（2）DNA的体外包装,在正常的噬菌体的生长期间，寄主细胞内要进行特殊的包装反应。作为包装反应的底物，即按照滚环复制机理合成的多连体形式的DNA，在具备噬菌体头部前体和A基因产物的条件下，会从cos位点处被切割成DNA单体分子。这种线形的分子适于包装，很快就被装填到头部外壳里边，而且由于它具有12bp长的粘性末端，所以又会重新环化起来。在基因D、基因W和F产物的存在下，最终形成成熟的噬菌体颗粒。,(267页),51,(267页),52,（2）DNA的体外包装,所谓DNA的体外包装作用，就是要在体外试管中，完成全部包装过程。体外包装的基本原理：*噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。*头部基因发生了突变，只形成尾部。*尾部基因突变只形成头部。*将这两种不同突变型的噬菌体提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。,(267页),53,(268页),琥珀突变型：使多肽链中途停顿的突变型，由于某一氨基酸的密码改变为UAG三联体的结果。,54,（2）DNA的体外包装,D基因突变的和E基因突变的噬菌体是一对互补的头部突变型噬菌体。E基因发生了琥珀突变，缺少E蛋白。D基因发生了琥珀突变，缺少D蛋白。将这两种不同突变型的噬菌体提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。（参考楼士林，11