某大学细胞凋亡与疾病医疗管理知识分析

第四章细胞凋亡与疾病,湖南中医药大学葛金文,细胞是组成机体的基本单位，其生命过程包括增殖、分化和凋亡。细胞通过分裂增加细胞的数量；通过分化形成在形态和功能上各异的细胞,组成不同的组织和器官；通过凋亡确保胚胎正常发育和内环境稳定。因此，细胞增殖、分化和凋亡都是主动而有序的生命过程，任何一个环节发生变化均可引起疾病。长期以来，生命科学的研究重点是细胞的增殖与分化，即细胞如何“活”的问题。20世纪90年代以来，对细胞凋亡的研究成为生命科学的重要课题，即研究细胞如何“死”的问题。,细胞凋亡与疾病,引言,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征三、细胞凋亡的调控机制四、细胞凋亡检测技术五、细胞凋亡与疾病,内容,细胞凋亡与疾病,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,细胞丢失,生理性死亡凋亡（apoptosis）,病理性死亡坏死(necrosis),死亡,细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。,排出,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡的研究历史,1951年GluckmannA和他的伙伴们首次介绍了程序性细胞死亡(programmedcelldeath)在胚胎发育中的重要性，他们证实了死亡是所有组织和器官发育的不可或缺的整合部分(GluckmannA.Celldeathsinnormalvertebrateontogeny.BiolRev.1951;26:59-86)。1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬机体无炎症反应。,1凋亡的发现及概念形成,KerrJFR,WyllieAH,CurrieAR.Apoptosis:abasicphenomenonwithwide-rangingimplicationsintissuekinetics.BrJCancer.1972;26:239-257.,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡的研究历史,2凋亡的形态学及生物化学研究（1972-1997）,利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。蛋白质水解酶活化的研究。钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。细胞膜的变化。,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡的研究历史,1)相关基因及调控2）信号转导3）各种分子及其相互作用及相互关系,3线粒体的变化及分子生物学研究（1998-）,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡的研究历史,疾病机制的研究以及新疗法的探索及问世,4临床应用研究阶段（2000-）,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡的研究历史,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡的研究历史,1995年至2007年4月CNKI收录以凋亡为主题词的论文篇数,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,（二）细胞凋亡的定义,细胞凋亡(apoptosis),apoptosis来源于希腊词,意指花瓣或树叶的脱落、凋零，强调这一过程是一种自然的生理过程。因此细胞凋亡可以定义为由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程。程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)一词最初是1956年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，强调的是其分子生物学和生理功能，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。现在,细胞凋亡和程序性细胞死亡作为同义词在学术界并用。,（三）细胞凋亡与细胞坏死的区别,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,（四）细胞凋亡的生物学意义,确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡可能会引起疾病发生。因此，对于细胞凋亡的研究，已成为医学科学界的关注热点。,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡与疾病,例如蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,细胞凋亡与疾病,（一）形态学特征,（1）凋亡的起始：微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细胞脱离，细胞质中，线粒体大体完整，染色质固缩；（2）细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；（3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围；（4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,细胞凋亡与疾病,（一）形态学特征,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,细胞凋亡与疾病,（二）生化特征,胞浆内Ca2+浓度升高。细胞内活性氧增多。质膜通透性变大。DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180200bp为基数的有序片段。型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。,典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带,细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。,典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳（呈现梯状条带）,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡的步骤：,接受凋亡信号,凋亡调控分子间的相互作用,蛋白水解酶的活化（Caspase）,进入连续反应过程,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,（二）凋亡的启动阶段,细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，目前比较清楚的通路主要有：,细胞凋亡的膜受体通路,细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经（线粒体通路）,细胞核途径,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,参与死亡受体信号转导的接头蛋白(死亡结构域蛋白deathdomainprotein）,TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD细胞凋亡FADD：Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associateddeathdomain）FasL+Fas（死亡结构域）+FADD细胞凋亡RIP：受体相互作用蛋白CRADD：含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡结构域蛋白,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡的两条通路：膜受体通路、线粒体通路,FasL（CD95）/Fas、TNF/TNFRTRAIL/TRAILR,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-relatedapoptosisinducingligand，TRAIL），或称凋亡素2配体（Apo2ligand，Apo2L）是肿瘤坏死因子（Tumournecrosisfactor，TNF）家族的成员。,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,1.膜受体通路,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,目前发现的受体/配体系统,凋亡是一种细胞自杀机制，它可以使复细胞动物在组织中控制细胞数量并清除威胁到动物生存的个别细胞。这种细胞表面拥有特殊传感器，称死亡受体（deathreceptor，DR）。死亡受体与其相应的配体结合，能够检测到死亡信号，从而快速启动细胞内的凋亡装置。目前已知的配体/受体系统主要有三个:FasL/Fas、TNF/TNFR及TRAIL/TRAILR。其中TRAIL/TRAILR是近年颇受瞩目的一种凋亡诱导系统。,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,2.线粒体通路,细胞凋亡线粒体信号通路研究中的重要发现,凋亡诱导因素,PTP开放,线粒体中细胞色素C等释放,Caspase-9活化,Caspase-3活化,apoptosis,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,（三）凋亡的执行阶段,尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1和Pro-IL-1，形成有活性的IL-1和IL-1；第二类参与细胞凋亡。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。,凋亡蛋白酶：Caspases:cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶）,是一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,三、细胞凋亡的调控机制,细胞凋亡与疾病,以无活性的形式存在。在Pro-Caspases的N端均含有一段的前区域（Prodomain）。活性形式均是由2个大亚基和2个小亚基组成的杂四聚体。一分子Pro-Caspase只能分裂产生1个大亚基和1个小亚基。在大亚基的C端均含有QACXG（X=R.Q或G）的活性中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故Caspase是属于半胱氨酸蛋白酶类。,Caspase的结构特征,凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD)核纤层（lamina）蛋白细胞骨架蛋白：导致细胞解体，形成凋亡小体其他的caspases灭活细胞凋亡的抑制物,Caspase的作用底物,使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD破坏细胞结构，如Lamina将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如Gelsolin,细胞凋亡与疾病,三、细胞凋亡的调控机制,(四)细胞凋亡相关基因,抑制凋亡基因：Bcl-2，IAP,促进凋亡基因：wtP53，Bax,双向调控基因：c-myc，Bcl-x,(1)Bcl-2家族分子结构,(3)BcL-2抗凋亡机制,直接的抗氧化抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制促凋亡的Bax，Bak细胞毒作用抑制Caspases激活维持细胞钙稳态,2.Fas,Fas属肿瘤坏死因子受体（TNFR)家族成员，Fas配体（FasL)属TNF家族成员。Fas是跨膜蛋白，由胞外区(157aa)，穿膜区(17aa)及胞浆区(145aa)组成。Fas胞浆区一段6070氨基酸序列与TNFR胞浆区高度同源，并介导细胞死亡，称之为死亡域(deathdomain，DD)。Fas较广泛地分布于多种类型的细胞。FasL与其受体Fas结合导致细胞凋亡。,C-myc是一种原癌基因，是调控细胞周期的主要基因。编码的蛋白是DNA结合蛋白，调控基因转录。在GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。,4、C-myc基因,5、IAP家族,IAP家族是一组具有BIR（baculoviralIAPrepeat)结构域和抑制凋亡的蛋白。IAP家族蛋白的BIR结构域是IAP抑制凋亡的结构基础。在人类已确定有6种IAP相关蛋白。在酵母和哺乳动物细胞中，IAP家族蛋白能通过抑制caspase-3,7,9等的活性。,6、其他基因,Jun、fos、myb、asy、Rb等基因都与细胞凋亡的发生有关,四、细胞凋亡的检测,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡的检测方法,.一、细胞凋亡的形态学检测.二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、线粒体膜势能（mt）的检测四、DNA片断化检测五、TUNEL法六、Caspase-3活性的检测七、WB检测八、凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析,细胞凋亡的形态学检测,1光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。3电子显微镜观察,NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess（488nm400）,电镜观察:凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）,磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。,AnnexinV-FITCFluorescence,PIFluorescence,TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemedium,ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI,线粒体膜势能（mt）的检测,线粒体荧光染料：Rhodamine123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,DNA片段化分析,细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝