第八章 微生物的遗传变异学PPT演示课件

第八章微生物的遗传变异与育种,第一节遗传变异的物质基础第二节微生物的基因组结构第三节质粒和转座因子第四节基因突变及修复第五节基因重组第六节微生物育种第七节菌种的衰退、复壮与保藏,1,遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能，变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体中以极低的几率（10-510-6）出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。遗传型（genotype）：一个生物体所含有的基因的总和。表型（phenotype）：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。饰变（modification）：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。举例：Serratiamarcescens的红色素在25和37的变化。,2,研究微生物遗传的意义,微生物的独特生物学特性：（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；,3,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,4,第一节遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）,5,1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌小鼠存活对小鼠注射活S菌小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌小鼠死亡抽取心血分离活的S菌,一、三个经典实验,（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith，研究对象：Streptococcuspneumoniae（肺炎双球菌）S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜,6,（2）细菌培养实验热死S菌不生长活R菌长出R菌热死S菌+活R菌长出大量R菌和10-6S菌,（3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状,7,加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,8,（二）噬菌体感染实验,A.D.Hershey和M.Chase，1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。,9,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,10,选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV）蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。,11,元病毒的发现和思考,元病毒含有微量的核酸，仍未发现？元病毒仅由蛋白质构成元病毒的遗传物质为蛋白质？,12,第二节微生物的基因组结构,基因组：细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的DNA序列。微生物的基因组一般较小，见P137,13,原核生物（大肠杆菌）的基因组,紧密缠绕的环状双链DNA分子遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子结构结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝基因组的重复序列少而短,14,真核生物（啤酒酵母）的基因组,DNA与组蛋白构成染色体有间隔子或内含子序列没有明显的操纵子结构含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复）遗传丰余：较高同源性的DNA重复序列,15,古细菌（詹氏甲烷球菌）的基因组,古细菌的基因组结构类似于细菌，即在环形DNA分子上功能相关的基因组成操纵子结构，无内含子序列。负责信息传递功能的结构（复制、转录和翻译）类似于真核生物，如启动子结构、复制起始因子、RNA聚合酶、翻译延伸因子等,16,第三节质粒和转座子,17,原核生物的质粒,定义：是一类小型共价闭合环状核外DNA，能独立于细胞核进行自主复制。可以通过交换掺入细胞核成为附加体；可以从寄主细胞中消除。近年来也发现了线性双链DNA质粒和RNA质粒大小：2100106Da，含有数个到数十个甚至上百个基因。性质：质粒是一种复制子，分为严紧型和松弛型，严紧型质粒的复制受细胞核控制，一般一个寄主细胞内有23个；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在细胞内的数量可以达到10-15个功能：进行细胞间接合并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。,18,原核生物的质粒,存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、StreptococcuslactisAgrobacteriumtumefaciensetal制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,19,几种代表性质粒：,1.F-因子（fertilityfactor）致育因子/性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。2.巨大质粒（mega质粒）为近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,20,3.Ti（毒性）质粒（tumoeinducingplasmid）即诱癌质粒。长200kb，是一种大型质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中。赋予宿主引起许多双子叶植物的根癌的特性。当带有Ti质粒的细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放至植物细胞中。含有复制子的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要形状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,21,4.Col因子（colicinogenicfactor）产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含Col因子的近缘的其它肠道细菌。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。有些G+细菌也产生细菌素，如用于食品保藏的NisinColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA的研究和用于体外复制系统上。,22,5.R（抗生素抗性和重金属抗性）因子（resistencefactor）最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性决定因子（r-determinant），RTF控制质粒copy数及复制，抗性决定因子带有抗生素或重金属的抗性基因。R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,23,6.降解性（代谢）质粒如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,24,7.隐秘质粒不显示任何表型效应，只能通过物理的方法检测的质粒。如酵母菌的2um质粒。,25,40年代B.McClintock对玉米的遗传研究而发现染色体易位，打破了基因是固定在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段的说法。有些DNA片段不但可在染色体上移动，而且还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。这似乎就是自然界所固有的“基因工程”。目前已把在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序称为转座因子（transposibleelement），也称作跳跃基因（jumpinggene）或可移动基因（movablegene）。,26,转座因子,插入（IS）序列转座子(Tn)特殊病毒（Mu噬菌体）,定义：可在DNA链上改变自身位置的一段DNA序列。,原核生物中的转座子类型,转座的遗传效应,27,插入序列（IS，insertionsequence),分子量最小（仅0.71.4kb），只有引起转座的转座酶基因而不含其它基因，具有反向末端重复序列。已在染色体、F因子等质粒上发现IS序列。E.coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS，通过这些同源序列间的重组，就可使F因子插入到E.coli的核染色体组上，形成Hfr菌株。因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS被切离时引起的突变可以回复，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。,28,转座子（Tn，transposon),转座子又称转位子或易位子分子量居中（一般为225kb）。除了与转座作用有关的基因外，还含有抗性基因（对抗生素、某些毒物）、乳糖发酵基因等几个至十几个基因。从结构来看，Tn有两种类型，即末端为反向或顺向重复的IS，或末端为反向重复的序列。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但并不完全是随机的，某些区域更易插入。,29,Mu噬菌体（即mutatorphage）,Mu噬菌体即诱变噬菌体是E.coli的一种温和噬菌体。含有噬菌体生长繁殖和转座所必需的基因，其分子量最大（39kb），含有20多个基因，但并没有固定的整合位置。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。,30,转座的遗传效应,插入突变产生染色体畸变（复制性转座子）基因的移动和重排,31,第四节基因突变及修复,32,一、基因突变,基因突变（genemutation）简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-810-9范围内。,33,(一)基因突变的类型（根据遗传信息的变化）,原序列5-AUGCCUUCAAGAUGUGGGMetProSerArgCysGly(1)同义突变5-AUGCCUUCAAGAUGUGGAMetProSerArgCysGly(2)错义突变5-AUGCCUUCAGGAUGUGGAMetProSerGlyCysGly(3)无义突变5-AUGCCUUCAAGAUGAGGAMetProSerArg(4)移码突变5-AUGCCUUCAAGUGUGGGMetProSerSerVal,34,突变类型突变株的表型成因检出方法营养缺陷型因突变而丧失合成一补充培养基（auxotroph）种或几种生长因子的能力不能在基本培养基上生长突变株抗性突变型因突变而产生了对某药物培养基（resistantmutant）种化学药物或致死物理因子的抗性条件致死突变型突变后在某种条件下培养条件改变（conditional可正常生长、繁殖并lethalmutant）实现其表型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型,35,突变株的表型成因检出方法形态突变型因突变而产生的个体形态Morphologycal或菌落形态的非选择（常用颜色变化）mutant性变异抗原突变型因突变而引起的抗原借助于抗原antigenic结构发生改变抗体反应mutant产量突变型因突变而获得的在有测定产量或highproducing用代谢物产量上高于其它mutant原始菌株的突变株其它突变型：毒力、糖发酵能力、代谢产物等,36,（二）突变率突变率:每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为10-8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，即可产生一个突变表型。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数突变率是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。,37,一些菌种某些性状的自发突变率,38,（三）突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。1.不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验）2.自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。3.稀有性：突变率低且稳定。4.独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。5.可诱发性：诱变剂可提高突变率。6.稳定性：变异性状稳定可遗传。7.可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变（forwardmutation），相反的过程则称为回复突变或回变（backmutation或reversemutation）。,39,（四）突变的机制,碱基置换（转换颠换）点突变移码突变（缺失添加）诱变畸变：缺失、添加、易位、倒位自发突变,突变,40,.诱变机制,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。,41,碱基置换（substitution）,定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（pointmutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类：转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；颠换（transversion），即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。,42,直接引起置换的诱变剂,一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起GCA：T外，其余都是可使GCA：T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。,43,碱基转换的分子机制,亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨作用，故它能使腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H），使胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U），从而发生转换。它也可使鸟嘌呤（G）变成黄嘌呤（X），但这时不能引起转换。其中AH而引起的转换过程分以下几个环节：腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤（He）；He通过自发的互变异构效应而形成Hk（酮式次黄嘌呤）；DNA双链第一次复制，结果Hk因其在6位上含有酮基，故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶（C）配对；DNA双链的第二次复制，这时其中的C按常规与G配对，因而最终实现了转换。,44,亚硝酸引起的使AT转换成GC过程的简式见下图,HNO2A:THe:THk+T第一次复制ATHkC第二次复制GCHkC,45,间接引起置换的诱变剂,引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP）等。它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起碱基置换，故是间接的。现以5-BU为例来加以说明。5-BU是T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-BU的培养液中时，细胞中有一部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。5-BU一般以酮式状态存在于DNA中，因而仍可正常地与A配对，这时并未发生碱基对的转换。有时5-BU会以烯醇式状态出现在DNA中，于是当DNA进行复制时，在其相对位置上出现的就是G，而不是原来的A，因而引起了碱基对从原来的AT变至GC的转换。,46,5-BU在以酮式或烯醇式状态存在时引起的ATGC的转换,A:TG:CA:TA:BukG:BueG:CG:BueA:TG:CA:BukA:BUG:CA:TA:BU,47,从上图中，还可看到5-BU的掺入引起的GC回复到AT的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。另外，也可以看到，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。,48,移码突变,移码突变（frame-shiftmutation）指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frameshiftmutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。丫啶类染料，如丫啶黄、丫啶橙和-氨基丫啶等，都是移码突变的有效诱变剂。,49,丫啶类化合物的诱变机制,至今还不很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。,50,丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示,正常DNA链上的三联密码子：ABCABCABCABCABCABCABCABC第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子：增添了一个碱基ABCABCAB+CABCABCABCABCAB在第二个密码子中缺失一个碱基A后引起的变化缺失了一个碱基AABCBCABCABCABCABCABCABCA增添一个碱基和缺失一个碱基后，其密码子又恢复正常：增添了一个碱基缺失一个BABCABCAB+CABCABCACABCABC增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常：加进了三个碱基ABCAB+CAB+CAB+CABCABC如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常：ABCACABCABABCACABCABCABC由此可见，在DNA链上增添或缺失一、二或四、五个碱基时，均可引起移码突变，而增添或缺失三个或六个时，则不影响读码，只引起短的缺失或增添（插入）。,51,染色体畸变（chromosomalaberration）,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，包括以下两个方面：染色体结构上的缺失（deletion）、重复（duplication）、易位（translocation）和倒位（inversion）染色体数目的变化。,52,染色体结构上的变化,染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；又如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。倒位是指断裂下来的DNA片段旋转180后，重新插入到原来染色体的位置上；易位则指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。,53,紫外线（U.V.，ultravioletray）对DNA的损伤,嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物，其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。,54,诱变因素在DNA上的初级效应遗传效应碱基类似物掺入作用AT=GC双向转换羟胺与胞嘧啶起反应GCAT的转换亚硝酸A、G、C的氧化脱氨作用AT=GC双向转换交联缺失烷化剂烷化碱基（主要是G）AT=GC双向转换烷化磷酸基团ATTA的颠换丧失烷化的嘌呤GCCG的颠换糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤丫啶类碱基之间的相互作用码组移动紫外线形成嘧啶的水合物GCAT转换形成嘧啶的二聚体码组移动电离辐射碱基的羟基化降解AT=GC双向转换DNA降解码组移动（或）糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤丧失嘌呤CGTA转换Mu噬菌体结合到一个基因中间码组移动,55,自发突变机制,自发突变是指在没有人工参与的情况下生物体自然发生的突变几种自发突变的可能机制背景辐射和环境因素的影响：由于一些原因不详的低剂量诱变因素的长期总和诱变效应。如各种短波辐射或高温诱变效应，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质（在微环境中有时也可能是高浓度）的作用等。微生物自身有害代谢产物的诱变效应：过氧化氢对Neurospora有诱变作用，在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因。氨基的互变异构效应：T和G会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现，而C和A则会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现。环出效应：在DNA的复制过程中，某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失。,56,基因突变的修复,光复活作用切除修复重组修复SOS修复,57,光复活作用（photoreactivation）,把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。光复活机理：经紫外线照射所形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中与光激活酶（photoreactivatingenzyme）（又称光裂合酶photolyase）结合，形成的复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。,58,暗修复作用（darkrepair）,暗修复作用又称切除修复（excisionrepair），是细胞内的主要修复系统，用于修复被诱变剂（包括紫外线、烷化剂、X射线和射线等）损伤后的DNA的机制。全部修复过程由四种酶完成，即内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5一侧切开一个3-OH和5-P的单链缺口；外切核酸酶从5-P至3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；DNA聚合酶修补缺口连接酶连接裂口,59,重组修复,一种越过损伤的修复机制，即通过交换，在嘧啶二聚体相应部位的子链上出现了缺口，该缺口由DNA聚合酶和连接酶修复。亲本链的嘧啶二聚体需切除修复,60,SOS修复,修复基因：lexA、recA、uvrA、uvrB、uvrC修复机理：lexA为调节基因，产生的阻遏蛋白在正常条件下与recA、uvrA、uvrB、uvrC的操作子结合，使细胞内仅合成少量的uvr蛋白（修复蛋白），对自发突变产生的低水平的损伤进行修复。当细胞内产生大量嘧啶二聚体时，在复制过程中因不能得到修复而在子链上留下空隙和单链，少量的RecA蛋白立即与单链结合并激活其活性，RecA蛋白降解LexA阻遏蛋白，解除了对RecA蛋白和其他修复蛋白基因的抑制，对大量的二聚体进行切除修复。,61,第五节基因重组,基因重组（generecombination）：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。重组是分子水平上的一个概念，而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexualhybridization）等原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。,62,基因重组的意义,基因重组是杂交育种的理论基础。杂交育种的优点：由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，故在方向性和自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。利用杂交育种可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象杂交育种的缺点：杂交育种的方法较复杂，目前还没有得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。,63,一、原核微生物的基因重组,转化转导接合原生质体融合,基因重组的方式,64,转化（transformation）,转化或转化作用：受体菌（recipient或receptor）直接吸收了来自供体菌（donor）的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌DNA的受体菌称为转化子（transformant）。范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。若干放线菌和蓝细菌及少数真核微生物也有转化报道。转化发生的条件两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。进行转化的受体细胞必须处于感受态（competence），亦即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转变成感受态,65,感受态因子：一种细胞外蛋白，可与受体菌细胞表面的特异受体结合，结果激活细胞内一系列与转化有关的基因的表达，其中产生的自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶裸露出来，以完成转化过程。不同细菌，每个细胞上的DNA结合位点数不同。转化因子的本质一般是DNA，经多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1107，约占细菌核染色体组的0.3%。据研究，呈质粒形式的转化因子，其转化频率最高；一般的转化因子都是线状双链DNA；也有线状单链DNA具有转化作用的报道。转化过程：以S.Pneumonia为例分为六阶段：,66,双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面的DNA结合位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合；在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段；DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的DNA片段不能进入细胞。来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对交换，形成了一个杂合DNA区段（heterozygousregion）。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与；受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,67,转染（transfection）：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。它与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。,68,转导(transduction),转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子（transductant）转导的方式：普遍转导转导局限转导,69,普遍转导（generalizedtransduction）通过完全完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段的误包，而实现其遗传性状传递到受体菌的转导现象,70,普遍转导（completetransduction）,P22噬菌体引起的S.typhimurum的普遍转导过程,71,局限转导（specializdtransduction）,概念：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。特点：仅转导供体菌的个别基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）；特定的基因由部分缺陷噬菌体携带；缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率误切（误切的频率一般在10-5左右，如E.coli噬菌体引起的半乳糖利用、产生物素基因的转导）而形成。,72,接合（conjugation）,概念：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。获得新性状的受体细胞称为接合子。存在范围：细菌和放线菌中都存在接合现象。E.coli的四种相互联系的接合型菌株：F+菌株、F-菌株F菌株Hfr菌株的概念F+F-FF-HfrF-的接合结果,73,F+F-FF-HfrF-的接合结果,F+F-2F+FF-2FHfrF-Hfr+受体菌获得Hfr菌株部分遗传性状,74,原生质体融合（protoplastfusion）,概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。原生质体融合的优点：可以提高重组率双亲可以少带标记或不带标记可进行多亲本融合有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量,75,原生质体融合操作示意图,去壁A+B-（高渗下）A+B-PEG或电脉冲离心促融去壁A-B+（高渗下）A-B+融合子（AA,BB,AB）长成菌落-检出A+B+融合子筛选优良性状的融合子,76,二、真核微生物的基因重组,真核微生物的基因重组的方式有性杂交：一般指性细胞之间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。准性杂交：同种生物的两个不同的体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子的杂交方式。,77,Saccharomycescerevisiae的杂交育种,过程：将甲亲本与乙亲本菌株（双倍体）分别接种到含醋酸钠等产孢子培养基斜面上，用蒸馏水洗下子囊，机械法破坏子囊获得子囊孢子，将子囊孢子铺平板获得单倍体细胞组成的菌落，通过离心等方法使单倍体细胞密集接触，即有机会产生双倍体的有性杂交后代。S.Cerevisiae的双倍体和单倍体细胞的比较,78,准性生殖（parasexualhybridization）,存在范围：常见于某些真菌，尤其是半知菌基本过程：菌丝连接形成异核体核融合体细胞交换Penicilliumurticae的准性生殖育种过程选择亲本：（用营养缺陷型作为遗传标记）强制异合：（用基本培养基筛选形成异核体的细胞和杂合二倍体细胞）移单菌落：（将在基本培养基上生长的单菌落移种到基本培养基斜面上）选择重组体：（采用各种选择培养基选择不同的融合子）,79,第六节微生物育种,自发突变与育种诱变育种,80,从生产中选育：在生产过程中，微生物以一定频率发生自发突变。为选育优良的生产菌种创造了机会。定向培育优良品种：一般指用某一特定因素长期处理某微生物的群体（culturepopulation），同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。采用梯度平板法（gradientplate）筛选抗代谢拮抗物的突变株，以提高相应代谢产物产量方面的工作，可认为是微生物定向培育技术的一大进展。例如，异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物（即结构类似物），筛选抗异烟肼的菌株，可得到吡哆醇的高产菌。,81,定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产突变株的方法,先在培养皿中加入10ml的一般琼脂培养基，使皿底斜放，待凝固后，将皿底放平，再在原先的培养基上倒10ml含有适当浓度（通过实验来决定）的异烟肼培养基，待凝。在制成的琼脂平板上存在一个由浓到稀的异烟肼的浓度梯度。然后涂以大量的酵母细胞，经培养后，在低浓度的异烟肼区域，长满了原始的敏感菌，在高浓度区域，酵母细胞生长受到了抑制，在浓度适中的部位出现少数由抗异烟肼的细胞所形成的菌落。这类抗性菌落可能因产生了可分解异烟肼的酶类，更多的是通过合成更高浓度的代谢产物吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制作用。在酵母菌中，通过梯度平板法曾获得吡哆醇产量比原菌株提高7倍的突变株。应用同样原理，还可获得其它种种有关代谢产物的高产菌株。,82,用梯度平板法定向培育若干代谢产物的高产突变株,代谢产物产生菌抗代谢物肌苷Bacilluspumibus8-氮杂嘌呤肌苷Corynebacteriumsp.6-巯鸟嘌呤腺嘌呤Salmonellatyphimutium2,6-二氨基嘌呤烟碱酸Chlamydomonaseugametos3-乙酰吡啶色氨酸Salmonellatyphi6-甲基色氨酸甲硫氨酸Escherichiacoli乙硫氨酸酪氨酸E.Coli对氟苯丙氨酸亮氨酸S.Typhi三氟-DL-亮氨酸吡咯叠氮Pseudomonasaureofaciens6-氟色氨酸,83,诱变育种,诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究之用。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,84,诱变育种的基本环节,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：绝大多数个体死亡出发菌株诱变多数未变少数存活少数突变多数幅度小少数正变多数不宜投产少数幅度大少数适宜投产可计算：存活率突变率正变率“高产率”“投产率”,85,诱变育种工作中应考虑的几个原则,选择简便有效的诱变剂：物理诱变剂：紫外线、激光；X射线、射线和快中子等。化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物。拟辐射物质：有些烷化剂例如氮芥、硫芥和环氧乙烷等除了能诱发各种点突变外，还能诱发一般只有辐射才能诱发的染色体畸变，所以它们也被称为拟辐射物质。由于一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。同样，凡能引起核酸的其他功能改变的因素，一般也能引起突变。,86,艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的基本原理,艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的基本原理Salmonellatyphimurium的组氨酸缺陷型（his）菌株在平板上不能生长，如发生回复突变则能生长。如将可疑“三致”物黄曲霉毒素，加入鼠肝匀浆，保温一段时间后，吸入滤纸片中，然后将滤纸片放置于平板中央。经培养后，出现三种情况：如在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂；如在纸片周围有一抑制圈，其外才是大量菌落，说明试样中某诱变剂的浓度很高；如在纸片周围即生长大量菌落，说明诱变剂的浓度合适。目前，艾姆斯试验法已广泛用于检测食品、饮料、药物核引水等试样中的致癌物。它具有快速（仅3天左右）、准确（检测致癌物的符合率85%）和费用省等优点。,87,选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)。采用简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反应的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。,88,充分利用复合处理的协同效应（synergism）,诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应，这对育种工作是很有参考价值的。复合处理有几类：两种或多种诱变剂的先后使用；同一种诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的同时使用。,89,挑选优良的出发菌株（originalstrain）,选用出发菌株的一般原则：最好是经过生产中选育过的自发变异菌株；采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株；细菌中发现称为增变菌株的变异菌株，更适宜作出发菌株；在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，最好考虑至少能累积少量所需产物或其前体的菌株，而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。,90,处理单孢子（或单细胞）悬液,对单细胞微生物必须处理单细胞、均匀悬液的原因分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂，避免长出不纯菌落。处理霉菌或放线菌孢子的原因：丝状微生物的细胞内同时含有几个核，故某一突变无法反映在当代的表型上。只有当经过DNA的复制发生细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落，这就叫表型延迟（phenotypiclag）（或由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，也会出现表型延迟）。这也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。细胞的生理状态对诱变的效果会发生很大的影响。获得均匀分散的细胞悬液的方法：用无菌的玻璃珠打碎成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤。诱变后出现的不纯菌落，则可用适当的分离纯化方法加以纯化。,91,利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,为了确切某一突变株产量性状的提高程度，必须进行大量的分析测定和统计工作，而一些形态变异虽能直接和迅速地加以观察，但又不一定与产量变异相关。如果能找到这两者间的相关性，则育种时初筛的效率就可大大提高。如在灰黄霉素产生菌荨麻青霉的育种中，发现菌落的棕红颜色变深者，产量往往有所提高；形态、生理与代谢产物产量间的相关性常常可通过人们的努力而加以创造。利用鉴别性培养基的原理或其它方法就可有效地把原来肉眼所观察不到的生理性状或产量性状转化为可见的“形态”性状。例如，在琼脂平板上，通过蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶变色圈的大小，抗生素抑制圈的大小，生长因子周围某菌生长圈的大小，以及外毒素的沉淀反应圈的大小等，都可用于初筛工作中估计某菌产生相应代谢产物能力的“形态”指标。,92,选用最适剂量,诱变剂剂量一般指强度与作用时间的乘积。各种诱变剂有不同的剂量表示方式，如化学诱变剂以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂的相对剂量。诱变剂的合适剂量：凡在提高诱变率的基础上，能扩大变异幅度，促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。要确定一个合适的剂量，常常要经过多次试验。就一般微生物而言，在一定的剂量范围内，突变率往往随剂量的增高而提高，但正变较多出现在偏低的剂量中，而负变则较多出现在偏高的剂量中；还发现经多次诱变