实验七+毛细管电泳和毛细管电色谱PPT演示课件

毛细管电泳和毛细管电色谱capillaryelectrophoresis,1,电泳electrophoresis是指溶液中带电粒子在电场作用下发生迁移的电动现象。,毛细管电泳capillaryelectrophoresis是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。,概念,毛细管电泳是一类以高压直流电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的新型液相分离分析技术。毛细管电泳是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学从微升水平得以进入纳升水平，并使单细胞分析成为可能。,2,毛细管电色谱（capillaryelectrochromatography;CEC）是毛细管电泳与液相色谱相结合形成的一种高效、快速微分离分析技术。,毛细管电色谱可以分离离子和中性分子。它是利用缓冲溶液的电渗流作为泵，使被分析的分子通过对其具有不同保留程度的第二相，达到分离的目的。,3,21.1毛细管电泳和毛细管电色谱的基本理论,21.1.1双电层和Zeta电势,4,21.1.2电泳,在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度或速率向其所带电荷相反电场方向迁移的现象叫作电泳。阴离子向正极方向迁移，阳离子向负极方向迁移，中性化合物不带电荷，不发生电泳运动。在充满自由溶液开口管中球形粒子的电泳速率公式为：电泳淌度（ep)定义为单位场强下离子的平均电泳速率，即,5,在电泳过程中还存在另一种电动现象，即电渗。当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，体相溶液整体朝向一个方向运动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。,21.1.3电渗流,6,21.1.3电渗流,以电场力驱动产生的溶液电渗流，与高效液相色谱中由高压泵产生的液体流型不同：电渗是CE的基本现象之一，它可以控制组分的迁移速率和方向，进而影响CE的分离效率和重现性，所以电渗流控制是CE中的关键问题或技术之一。,7,21.1.4.电渗流的控制,影响电渗流的因素很多，直接影响因素有：1.电场强度2.温度3.pH值4.缓冲液溶剂5.离子强度6.添加剂7.管壁涂层,8,21.1.5.分离原理,电泳和电渗流并存，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内电介质中的迁移速率是两种速率的矢量和：在典型的毛细管电泳分离中，溶质的分离基于溶质间电泳速率的差异。电渗流的速率绝对值一般大于粒子的电泳速率，并有效地成为毛细管电泳的驱动力。溶质从毛细管的正极端进样，带正电的粒子最先流出，中性粒子次之，带负电的粒子在中性粒子之后流出。溶质依次通过检测器，得到与色谱图极为相似的电泳分离图谱。,9,21.1.5.分离原理,毛细管电色谱由于引入了色谱机制，其保留机理包括两个方面:其一，如同HPLC，基于溶质在固定相和流动间分配过程；其二，如同CE，基于溶质电迁移过程。由于CEC既能分离电中性溶质，又能分离带电溶质，对复杂的混合样品显示出强大的分离潜力。,10,21.2.毛细管电泳和电色谱仪器装置,21.2.1.仪器基本结构,11,21.2.2.进样系统,毛细管分离通道十分细小，整个柱体积一般只有45L，所需的样品区带只有几纳升。毛细管电泳的进样方式一般是将毛细管的一端从缓冲液移出，放入试样瓶中，使毛细管直接与样品接触，然后由重力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。CE进样技术均适用于CEC。,一般的进样方式是电动进样和压力进样。电动进样是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加压力，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。压力进样是用压差使试样溶液进入毛细管。产生压差的办法可以采用在检测器端抽真空，或者通过提高试样端液面。,12,21.2.3.电源及其回路,电流回路系统包括高压电源、电极、电极槽、导线和电解质缓冲溶液等。CE和CEC一般采用030kV连续可调的直流高压电源。理想的电源应具备：1.能输出单极直流高压(一端接地)；2.电压、电流、功率输出模式任意可选；3.能控制电压、电流或电功率的梯度；4.电压输出精度应高于1%。CE的电极通常由直径0.5lmm的铂丝制成。电极槽，即缓冲液瓶，通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料瓶(15mL不等)，要便于密封。缓冲液内含电解质，充于电极槽和毛细管中，通过电极、导线与电源连通，一同构成整个电流回路。,13,21.2.4.毛细管及其温度控制,熔融石英毛细管在CE中应用最广泛，熔融石英拉制得到的毛细管很脆，易折断，一般在外表面涂有聚酰亚胺保护层，使之变得富有弹性，不易折断。内径越小，表面积/体积比越大，散热效果越好。内径小，样品负载小，检测、进样、清洗等操作困难。一般使用的毛细管柱内径在25100m之间，目前最常用的是50m和75m两种。检测窗口部位的外涂层剥离。焦耳热效应产生径向温度梯度，还会导致分离重现性差。商品仪器大多有温度控制系统，主要采用风冷和液冷两种方式。一般采用物理吸附或化学键合两种方式形成毛细管内壁涂层，对石英毛细管进行改性或修饰，可有效控制电渗流、抑制吸附进而优化分离。,14,21.2.5.检测系统,15,21.3.毛细管电泳分离模式及应用,21.3.1.毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresis;CZE）21.3.1.1.基本操作条件毛细管区带电泳也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管电泳最基本、也是应用最广的一种操作模式。其分离原理是基于样品组分荷质比的差异。需要控制的操作变量主要是电压、缓冲液浓度、pH值和添加剂等。缓冲液的选择通常须遵循下述要求：1在所选择的pH范围内有合适的缓冲容量。2本底检测响应低。3自身的淌度低，即离子大而荷电小。,16,21.3.1.毛细管区带电泳（CZE）,在CZE分离中，除了背景电解质外，常常还在缓冲溶液中加入某些添加剂：1.中性盐2.表面活性剂3.手性添加剂,对于许多水难溶的样品，如果在缓冲液中加入少量的有机溶剂，常常能有效改善分离度。在极端情况下，可完全使用有机溶剂，或以有机溶剂为主体，这就是非水毛细管电泳技术。,图21-6电渗流反向示意图,17,21.3.1.毛细管区带电泳（CZE）,21.3.1.2.应用毛细管区带电泳特别适合分离带电化合物，包括无机阴离子、无机阳离子、有机酸、胺类化合物、氨基酸、蛋白质等，不能分离中性化合物。,毛细管区带电泳3分钟内分离30种阴离子电泳图,18,21.3.2.毛细管凝胶电泳（CGE）,毛细管凝胶电泳(capillarygelelectrophoresis;CGE)是在毛细管中充填多孔凝胶作为支持介质进行电泳，其分离是基于筛分机理。CGE常用于蛋白质，寡聚核苷酸、RNA及DNA片段的分离和测定。凝胶是毛细管电泳的理想介质，粘度大，抗对流，能减少溶质的扩散，因此能限制谱带的展宽，所得的峰型尖锐，柱效高，有可能使组分在短柱上实现极好的分离。常用的凝胶有聚丙烯酰胺和琼脂糖，应用最多的是前者。,19,填充柱毛细管电色谱基于填充柱的电色谱是各种电泳中最新出现的一种技术。它是利用电渗透驱动极性溶剂通过反相高效液相色谱毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。胶束电动毛细管色谱是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂。胶束相在分离中起到了准固定相的作用，电中性的有机化合物按照它们在水相和有机相之间分配系数的差异进行分离。该方法也可用来改善带电有机化合物的分离选择性。,21.3.3.毛细管电色谱（CEC）,将CE的高效柱和HPLC的高选择性有机结合起来，开辟了高效的微分离技术新途径，它的分离过程包含了电泳和色谱两种机制，溶质根据他们在流动相和固定相的分配系数不同和自身的电泳淌度差异而分离。,20,胶束电动毛细管色谱（MEKC）,MEKC是在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束，成为分离体系的准固定相，溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。,21,胶束电动毛细管色谱（MEKC）,MEKC是在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束，成为分离体系的准固定相，溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。,电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；可用来分离中性物质色谱与电泳分离模式的结合。,22,毛细管电动色谱的优点,像高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。像毛细管电泳法，不需要压力泵系统的情况下，提供了微量体积试样溶液的高效分离通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相的。明显地简化了