构建shRNA干扰稳定细胞系-硕士.pptx

创造价值，追求卓越,BioChen出品,构建shRNA干扰稳定细胞系,设计siRNA序列根据siRNA序列设计shRNA片段构建shRNA干扰质粒瞬时转染检测干扰效果构建稳定细胞系,选择设计siRNA，而不是shRNA；输入基因的登录号或者序列；使用默认参数或者按需修改参数。,使用BLOCK-iTRNAiDesigner设计siRNA序列,综合Rank、Tushcl规则，选择3条左右进行实验验证，siRNA不是100%有效果的。,使用BLOCK-iTRNAiDesigner设计siRNA序列,pRNAT-U6.1/Neoisdesignedformammaliantransfection.ItcarriesaNeomycinresistancegeneastheselectablemarker,whichcanbeusedforestablishingstablecellline.TheGFPmarker(coralGFP,cGFP)underCMVpromotercontrolcanbeusedtotrackthetransfectionefficiency.ItusesU6promoterforsiRNAexpression.,索取质粒，请联QQ：676743449）,pRNAT-U6.1/Neo质粒,右图是pSUPER质粒的设计图，与pRNAT-U6.1/Neo区别不大。序列转换工具（反向、互补、反向互补）：,shXRN1-S、shXRN1-AS（59nt）送到DNA合成公司按照合成引物的方式合成,根据siRNA序列设计shRNA合成片段,1、将合成的两条链稀释成10uM，各取10ul，退火（95度5分钟，缓慢降至室温，可以用PCR仪做）；2、用BamHI和HindIII将pRNAT-U6.1/Neo质粒切开（质粒不需要很多，但务必切干净），回收；3、连接（2ul载体、1ul酶、4ul5Xbuffer、13ul片段）、转化；4、挑单克隆，摇菌，提质粒，酶切（BamHI/HindIII)验证（质粒多切一点，如果切出60bp左右的带是阳性克隆）；5、送测序。,质粒构建,将shRNA干扰质粒瞬时转染，提取mRNA做半定量PCR，或者提取蛋白做western检测干扰效果。如下图，sh1和sh2有效果，sh3没有效果。,瞬时转染检测干扰效果,构建shRNA稳定表达细胞系,将pRNAT-U6-shRNA质粒用BglII酶切线性化（必须的，可以增加整合效率），回收，转染进10cm培养皿的细胞，转染后48小时加G418筛选。不同细胞对G418敏感情况不一样，之前需要做好浓度测试（Hela细胞对应的G418浓度）大概是500ug/ml-1000ug/ml。一开始细胞会大量死去，10cm皿传6cm，6cm皿传3.5cm皿（细胞太稀不利于生长）。之后细胞会增长，3.5cm皿传6cm皿，6cm皿传10cm皿。当90%以上的细胞都有荧光之后，这个稳定细胞系差不多就成功了。然后做一下实时定量