基因工程-第五章-克隆重组体的构建、转化PPT演示课件

2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第一节受体细胞受体细胞（receptorcell）或称宿主细胞（hostcell）：能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。选择受体细胞的基本原则便于重组DNA分子的导入能使重组DNA分子稳定存在于细胞便于重组子的筛选遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长安全性高，无致病性内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量最低在遗传密码的应用上无明显偏倚性有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效分泌表达,1,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第一节受体细胞受体细胞的选择限制缺陷型大肠杆菌的限制系统主要由hsdR基因编码，因此具有hsdR遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了降解外源DNA的能力，同时大大增加了外源DNA的可转化性。重组缺陷型大肠杆菌中存在着两条体内同源重组的途径，即RecBCD途径和RecEF途径，前者远比后者重要，但两种途径均需要RecA重组蛋白的参与。因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其相应的基因型为recA-、recB-、recC-.遗传互补型感染寄生缺陷型,2,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第一节受体细胞常用的受体细胞原核生物细胞大肠杆菌（G-）、枯草杆菌（G+）、蓝细菌真菌细胞酵母菌植物细胞水稻、棉花、玉米、拟南芥等动物细胞小鼠L细胞、Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等,3,2020/5/24,苏,各种基因工程受体的特性,大肠杆菌,遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定,适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌,产结构复杂、种类繁多的内毒素,4,2020/5/24,苏,各种基因工程受体的特性,枯草杆菌,遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素,适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌,遗传欠稳定，载体受体系统欠完备,5,2020/5/24,苏,各种基因工程受体的特性,链霉菌,抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素,主要用于抗生素生产菌株的改良,遗传不稳定，生长相对缓慢,6,2020/5/24,苏,各种基因工程受体的特性,酵母菌,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，遗传稳定,适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,不含有特异性的病毒、不产生毒素,内源性蛋白产物种类繁多且含量高,具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统,7,2020/5/24,苏,各种基因工程受体的特性,昆虫细胞（家蚕）,具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定,适用于真核生物基因的高效表达,DNA重组操作系统欠完善,8,2020/5/24,苏,各种基因工程受体的特性,哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）,与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统,适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,细胞培养条件苛刻，生长缓慢,9,2020/5/24,苏,各种基因工程受体的特性,植物细胞（拟南芥菜、烟叶）,农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用,适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良,遗传操作繁琐,10,2020/5/24,苏,11,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第二节重组DNA分子导入宿主细胞以质粒为载体：转化作用、接合作用以噬菌体为载体：转染作用、转导作用一、重组质粒DNA分子转化E.coli转化（transformation）：重组子通过与膜蛋白结合进入受体细胞并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。细菌感受态的形成（感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞）转化因子的吸收整合复合物前体的形成单链DNA转化因子的整合转化子的形成,12,2020/5/24,苏,13,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第二节重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.coliCa2+诱导转化利用CaCl2处理E.coli，能够促进其对噬菌体DNA、质粒DNA的吸收，重复性好，操作简便，适合成批制备感受态细胞,14,2020/5/24,苏,15,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第二节重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.coli电穿孔转化法利用高压脉冲作用，在E.coli细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。需在低温下（0-4）进行，转化效率高。,16,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第二节重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.coli接合转化法（三亲本杂交接合转化法）基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式非接合型质粒由于缺少编码接合转移基因的功能区，因此不能直接通过细胞接合转化受体细胞，但当同一细胞中共存一个含有接合功能的辅助质粒，则这些非接合型质粒通常也会被转移。,17,2020/5/24,苏,18,2020/5/24,苏,19,2020/5/24,苏,细菌原生质体的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化,20,2020/5/24,苏,细菌原生质体的转化,不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂,细菌原生质体的制备：,21,2020/5/24,苏,转化率,转化率的定义,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）,22,2020/5/24,苏,转化率,转化率的定义,例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA,23,2020/5/24,苏,转化率,转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模,例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，,经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个,重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？,若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：,104/107X10-2=0.1mg载体DNA,考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：,0.1/20%=0.5mg载体DNA,载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算,出（5mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选,24,2020/5/24,苏,转化率,转化率的影响因素,载体及DNA重组分子方面：,载体本身的性质：,不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同,载体的空间构象：,质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载,体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的,超螺旋质粒低两个数量级,插入片段的大小：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低,25,2020/5/24,苏,转化率,转化率的影响因素,受体细胞方面：,受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高,26,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第二节重组DNA分子导入宿主细胞二、重组噬菌体DNA分子导入E.coli转染（transfection）：将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。转导（transduction）：通过噬菌体颗粒感染宿主细胞，把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。转导前必须对重组DNA分子进行人工体外包装，使其成为具有感染活力的噬菌体颗粒。,27,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第二节重组DNA分子导入宿主细胞三、重组DNA分子导入植物细胞农杆菌介导的Ti质粒载体转化法叶盘法转化植物细胞整体植株接种转化法原生质体共培养转化法悬浮细胞共培养转化法,28,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第二节重组DNA分子导入宿主细胞三、重组DNA分子导入植物细胞DNA的直接转移法多聚物介导法PEG法(聚乙二醇法)电穿孔（electroporation）转化法激光微束穿孔转化法显微注射法（microinjection）超声波介导转化法基因枪法(particlegun)脂质体介导法（liposome）花粉管通道法,29,2020/5/24,苏,电穿孔（electroporation）转化法细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适当的外加电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会导致细胞致命的伤害，当移去外加电压后被击穿的膜孔可自行修复。显微注射法（microinjection）利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。基因枪法(particlegun)利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA随之带入细胞进行表达的基因转化方法。脂质体介导法（liposome）脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。,30,2020/5/24,苏,7显微注射法约110%直接注射入细胞质或细胞核内显微注射法利用显微操纵器，将DNA直接注射到细胞核中穿刺法利用注射显微镜将微注射针固定，然后穿刺将DNA注入细胞核内,31,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第二节重组DNA分子导入宿主细胞四、重组DNA分子导入哺乳动物细胞病毒颗粒转导法磷酸钙转染法DEAE-葡聚糖转染法聚阳离子-DMSO转染法显微注射转基因技术电穿孔DNA转移技术脂质体介导法,32,2020/5/24,苏,选择方法的依据：1转化频率取决于以下几个因素：1)外源DNA能否易于进入宿主细胞；2)重组DNA分子能否自主复制3)标记基因表达效率2.检测转化体的方法：是否具有选择压力3.生物材料的种类：细胞大小，有无细胞壁，除去细胞壁后的原生质体能否易于再生4.已有实验条件：仪器，载体种类等,33,2020/5/24,苏,第三节重组子的筛选,34,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第三节重组子的筛选一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选转化子载体DNA分子上通常携带有一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特征，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。,35,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第三节重组子的筛选一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选转化子抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选氨苄青霉素ampicillinAp或Amp氯霉素chloramphenicolCm或Cmp卡那霉素kanamycinKn或Kan四环素tetracymicTc或Tet插入失活筛选插入表达筛选,36,2020/5/24,苏,抗药性筛选法的基本原理：,将外源DNA片段插在EcoRI位点：,将外源DNA片段插在BamHI位点：,重组子呈Apr、Tcs,37,2020/5/24,苏,插入失活筛选法,抗药性筛选法的基本操作：,先将转化液涂布含有Ap的平板,再将Ap平板上的转化子影印至,含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生长、但在Ap和Tc,平板上不长的转化子即为,重组子,38,2020/5/24,苏,插入失活筛选法,39,2020/5/24,苏,插入失活筛选法,40,2020/5/24,苏,插入失活筛选法,41,2020/5/24,苏,插入表达筛选法,42,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,第三节重组子的筛选一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选转化子显色互补筛选法E.coli的载体质粒上含有lacZ基因，其表达产物为无活性的酶，称为受体，而在受体细胞存在相应的供体编码序列。无论在胞内还是胞外，受体一旦与供体结合，便可以恢复-半乳糖苷酶的活性，在含有X-gal和IPTG的培养基中形成蓝色菌落。当目的基因插入到lacZ区段时，受体无法形成，便不能转译形成-半乳糖苷酶，因而在含有X-gal和IPTG的培养基中形成白色菌落。,43,2020/5/24,苏,lacZ的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,44,2020/5/24,苏,45,2020/5/24,苏,46,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,营养缺陷型检测法根据目的基因在受体细胞中的表达产物的性质，筛选含有目的基因的克隆子。基因产物能降解某些药物使得菌株呈现出抗性标记基因产物与某些药物作用呈现颜色反应,47,2020/5/24,苏,形成噬菌斑筛选法对噬菌体载体系统，外源DNA插入载体后，重组分子大小必须在野生性DNA长度的78%-105%，才能在体外包装成具有感染活力的噬菌体颗粒，转导受体菌后，转化子在培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子能正常生长。,48,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,二、利用重组子结构特征分析的筛选法根据外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子。重组子中插入了外源DNA片段，分子质量较载体DNA分子大，在琼脂糖凝胶电泳时迁移速率较慢。限制酶酶切分析法从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，然后用限制酶酶解，并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入以及插入的方向。利用PCR方法筛选确定重组子,49,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,50,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,区分重组子与非重组子,用BamHI酶切转化子质粒DNA,电泳观察酶解产物片段,重组子：2.7kb+4.0kb,非重组子：2.7kb,如果外源DNA片段也是2.7kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然,后通过其长度来鉴定其是否为重组子,51,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,S,S,B,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,区分重组子与非重组子,如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1/50,52,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,区分目的重组子与非目的重组子,用EcoRI酶切转化子质粒DNA,目的重组子：3.0kb+3.7kb,或者：1.0kb+5.7kb,用PstI酶切转化子质粒DNA,目的重组子：3.2kb+3.5kb,或者：0.8kb+5.9kb,53,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,4.0kb,2.0kb,2.0kb,区分目的重组子与非目的重组子,对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0kb和2.7kb两条带子，实际上2.0kb的条带中含有两种不同的分子,2.7kb,2.0kb,E,54,2020/5/24,苏,55,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,部分酶解图谱法：,该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：,BamHI全酶解：0.60.81.83.4kb,BamHI+EcoRI全酶解：0.60.81.81.22.2kb,其中，1.2kb片段的存在表明该片段位于一端,BamHI部分酶解：1.42.64.0kb,其中，1.4kb的片段必为0.6kb和0.8kb两片段，表,明两者是连在一起的；同理，2.6kb的片段必为0.8,kb和1.8kb两片段，表明两者是连在一起的；最后，,4.0kb的片段必为0.6kb和3.4kb两片段，表明两者,是连在一起的,56,2020/5/24,苏,三、核酸分子杂交检测法具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链，在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则，高度特异性地复性形成双链。杂交的双方是：待测的核酸序列+已知序列的核酸探针。包括种类：菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。,57,2020/5/24,苏,放射自显影,在标记了放射性同位素的细胞、组织、切片或其它生物样品上，压上一张X光胶片，放射性同位素的电离辐射作用于x光胶片上的乳胶，就像可见光一样产生了一个潜在的图象。因此，经过曝光，射线与乳胶作用产生电子，电子使卤化银还原成金属银，这样，便得到了放射性同位素的分布图。在细胞水平上，放射自显影可用来确定生物大分子的合成部位，以及随后在细胞内的运动情况。如：通过掺人H标记的脱氧胸腺嘧啶核甘酸，我们得知细胞核是DNA合成的主要部位。,58,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,三、核酸分子杂交检测法1、菌落原位杂交法直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上通过溶菌和变性处理，使DNA暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑,59,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,菌落原位杂交法的基本操作：,影印,用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板,洗涤,杂交,感光,用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜,用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜,80烘干固定影印薄膜,薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温,用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜,用X光胶片覆盖薄膜感光,60,2020/5/24,苏,61,2020/5/24,苏,62,2020/5/24,苏,63,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,三、核酸分子杂交检测法2、Southernblotting根据毛细管作用原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，以检测这些被转移的DNA片段。是针对DNA分子进行的印迹杂交技术。,64,2020/5/24,苏,65,2020/5/24,苏,66,2020/5/24,苏,Southern杂交检测DNA,67,2020/5/24,苏,Southern杂交检测DNA,68,2020/5/24,苏,3、Northernblotting是指将RNA分子变性及电泳分离后，从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法。是针对RNA分子进行的印迹杂交技术。注意的两个问题：防止单链RNA形成高级结构，必须采用变性凝胶电泳电泳过程中始终要防止Rnase的作用，防止RNA分子的降解4、Dotblotting（斑点印迹杂交）或Slotblotting（狭线印迹杂交）,69,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,三、核酸分子杂交检测法5、核酸探针核酸探针的种类同源或部分同源探针是指与目的基因的部分序列完全互补的核酸探针，主要用于从cDNA或基因组DNA文库中筛选含有目的序列的克隆子。cDNA探针如果拥有目的基因的mRNA，则可通过逆转录酶将其反转录成单链cDNA，以cDNA为探针无论在长度还是在同源性上都较为理想。人工合成的寡核苷酸探针根据目的蛋白的一段已知氨基酸序列推导合成的，简并性和稳定性。,70,2020/5/24,苏,71,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,三、核酸分子杂交检测法5、核酸探针探针标记放射性标记32P3H35S非放射性标记生物素（biotin）探针标记方法切口平移标记法随机引物标记法末端标记法,72,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,杂交探针的标记：ABC荧光标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,荧光胺,Biotin生物素,Avidin,生物素结合蛋白,烷烃连接臂,73,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,杂交探针的标记：ABC显色酶标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,显色酶,Biotin生物素,Avidin生物素结合蛋白,烷烃连接臂,生色底物,颜色产物,74,2020/5/24,苏,75,2020/5/24,苏,76,2020/5/24,苏,77,2020/5/24,苏,克隆DNA序列检测,杂交探针的标记：地高辛系统标记,dUTP-连接臂-甾醇半抗原,digoxigeninDIG,抗体-显色酶交联复合物,78,2020/5/24,苏,杂交探针的制备：,用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：,单链结构（双链DNA可用碱变性）,足够长度（至少12个碱基）,内部不含互补区,探针的制备方法或来源包括：,人工合成,cDNA合成,同源序列,mRNA,79,2020/5/24,苏,杂交探针的标记：T4-PNP介导的末端标记,5HO,3HO,OH3,OH5,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,5p,3HO,OH3,p5,80,2020/5/24,苏,杂交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记,3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT,5mRNA,反转录酶,Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）,5TTTTTTTTTTT,5mRNA,3cDNA,3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT,5TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA,81,2020/5/24,苏,杂交探针的标记：DNA聚合酶介导的缺刻前移标记,5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3,3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5,Mg2+5dNTP5pppdA（a-32P-dATP）,5G-C-T-CA-G-C-T-G-GA-G-T3,3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5,5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3,3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5,DNaseI,DNApolI,82,2020/5/24,苏,83,2020/5/24,苏,84,2020/5/24,苏,外源基因产物检测,四、蛋白质生物功能测定法,淀粉酶目的基因的鉴定：,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水,的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将,待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可将,其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性,的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。如果透,明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，,易于辨认。,蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定,85,2020/5/24,苏,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生,86,2020/5/24,苏,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,目的重组子,诱导抗性,抽取重组质粒,再次转化,87,2020/5/24,苏,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,DNA结合蛋白编码基因的鉴定：,影印,用聚乙烯薄膜影印裂解平板,洗涤,杂交,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定,80烘干固定影印薄膜,与探针溶液中杂交,洗涤、干燥、感光,用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板,聚乙烯膜,探针选用能与,目标蛋白特异,性结合的DNA,片段,88,2020/5/24,苏,外源基因产物检测,蛋白质生物结构鉴定法,放射免疫原位杂交鉴定：,影印,用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印,洗涤,与I125标记的IgG保温,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定,与I125标记的IgG保温,洗涤、干燥、感光,用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板,含抗体的聚乙烯膜,裂解平板,89,2020/5/24,苏,90,2020/5/24,苏,91,2020/5/24,苏,外源基因产物检测,蛋白质生物结构鉴定法,免疫沉淀鉴定：,在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体,然后涂布转化液,37培养,经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标,蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀,反应，在菌落周围形成白色的圆斑,此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大,92,2020/5/24,苏,外源基因产物检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选,93,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,五、克隆基因定位法任务：对阳性重组子进行目的基因的定位1、亚克隆法（subcloning）从一个克隆的DNA片段上分割几个区域、分别将之再次克隆在新的载体上，获得一系列新的重组子，这个过程称为次级克隆。,94,2020/5/24,苏,95,2020/5/24,苏,96,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,1、亚克隆法（subcloning）存在问题：亚克隆酶切位点可能位于目的基因内部解决办法：利用Bal31缩短无关DNA序列,97,2020/5/24,苏,98,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,2、插入灭活法将特定的DNA随机插入到重组DNA分子中获得一系列插入重组子，根据其突变的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。接头插入突变转座子诱变,99,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,2、插入灭活法接头插入突变用DNaseI随机切割重组DNA分子用EcoRI甲基化酶处理线性DN八分子DNA聚台酶将线性DNA分子的两端补平连接酶的作用下平末端接上EcoRI接头EcoRI酶消化T4DNA连接酶作用使DNA分子重新环化转化受体细胞筛选鉴定。由于EcoRI接头的插入可能导致克隆化目的蛙因的失活，因此旦发现目的基因失活后，便可通过接头插入位点，将克隆化目的基因位置确定下来。,100,2020/5/24,苏,101,2020/5/24,苏,第五章克隆重组体的构建、转化,六、电子显微镜作图检测法1、变性作图用于DNA分子中AT丰富区段的鉴定2、异源双链定位法利用两条不同ssDNA分子间一定的同源区段复性形成部分双链结构来区分3、R环检测法鉴定dsDNA分子中与特定R