第2节_基因工程的基本操作程序.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建（核心）,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,一、基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,(一)目的基因：主要是_,编码蛋白质的基因,（二）获取目的基因的常用方法,从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,人工合成,1)基因文库,1.从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,2)基因文库的种类:,种类,基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,cDNA文库的构建-反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,杂交双链(单链RNA/单链DNA),单链DNA,双链DNA(cDNA),目的基因的mRNA,3)目的基因获取的依据:P9,基因的核苷酸序列,基因的、基因的、基因的。,基因在染色体上的位置,转录产物mRNA,翻译产物蛋白质,功能,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术。,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,2.利用PCR技术扩增目的基因,前提条件:,有一段已知目的基因的序列，以使根据这一序列合成。,核苷酸序列,引物,原理：,DNA双链复制,（DNA热变性原理、DNA的方向、引物、TaqDNA聚合酶）,1.变性（90-95）双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,氢键,单链DNA,2.复性(55-60)温度降低，与DNA模板结合，形成局部_。,双链,引物,3.延伸（70-75）在的作用下，从引物的连接，合成与模板互补的DNA链。,3端,脱氧核苷酸,Taq酶,过程:,动态演示具体过程,扩增形式及结果：,指数扩增，数量约为。（n代表）,2n,扩增循环的次数,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制(PCR扩增仪内),主要在细胞核内,热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,解旋酶、普通的DNA聚合酶等,3.人工合成,1)反转录法：,杂交双链(单链RNA/单链DNA),单链DNA,双链DNA(cDNA),目的基因的mRNA,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脱氧核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,3.人工合成,基因较小，核苷酸序列己知,甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是（）A甲方法可建立该细菌的基因组文库B乙方法可建立该细菌的cDNA文库C甲方法要以脱氧核苷酸为原料D乙方法需要逆转录酶参与,C,二、基因表达载体的构建（核心）,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用,1、基因表达载体构建的目的,2、基因表达载体的组成,启动子,目的基因,终止子,标记基因,位于基因的首端,它是mRNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。,位于基因的末端,终止转录。,鉴别受体细胞中是否含有目的基因,1.构建基因表达载体需要哪些工具？,限制酶、DNA连接酶、运载体。（其中有两种工具酶）,探讨,用同一种限制酶切割表达载体和目的基因,3、基因表达载体的构建步骤,DNA连接酶将目的基因和表达载体进行“缝合”,形成重组DNA分子,2.为什么要构建基因表达载体？为什么不能将目的基因直接导入受体细胞？,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因能够表达和发挥作用。目的基因一定是经过限制酶切割过的基因，那么其结构已经不完整，缺少启动子等调控序列，不可能在受体细胞中表达和发挥作用，会作为异物被分解或派出。,探讨,3.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。,探讨,4.两种不同生物的DNA能拼接的遗传学理论基础是什么？,都以DNA为遗传物质；都有四种脱氧核苷酸；都具有规则的双螺旋结构；都遵循碱基互补配对原则；共用一套密码子。,探讨,三.将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法（感受态细胞）,_进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,目的基因,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞,(1)农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,三.将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法（感受态细胞）,_进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,目的基因,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞,(1)农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,显微注射技术（最常用，最有效）,2.将目的基因导入动物细胞,方法,受体细胞,常用受精卵,3.将目的基因导入微生物细胞,方法,Ca2+处理法,常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。,过程：,Ca2+处理受体细胞,感受态细胞,重组表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,受精卵体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射技术,用Ca2+处理成感受态细胞,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,1、导入检测（复制水平的检测）,目的：,方法：,DNA分子杂交技术,四.目的基因的检测与鉴定,从转基因生物中提取的基因组DNA,探针？,杂交的对象？,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探针,转基因生物的DNA,变性,变性,14N,过程,.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中,1、导入检测,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,2、转录检测,目的：,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法：,分子杂交技术,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,探针？,杂交的对象？,从转基因生物中提取的mRNA.,3、翻译检测,目的：,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原抗体杂交技术,从转基因生物中提取的蛋白质,抗原？,抗体？,将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体,4、个体生物学水平的鉴定,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因判断下列说法正确的是（）A将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的不能