MLST方法原理、数据处理及应用介绍

MLST方法原理及应用介绍,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室周海健,常用细菌分子分型方法的比较,分子分型主要的三种实验数据形式,1.图像数据：脉冲场凝胶电泳（PFGE)随机扩增多态性DNA分析（RAPD)扩增片断长度多态性分析（AFLP）核糖体分型（Ribotyping）2.分类数据：多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）多位点序列分析（MLST）单碱基核苷酸多态性分析（SNP）3.序列数据：全基因测序特异基因、基因簇测序（如军团菌的mip基因测序、脑膜炎奈瑟菌的PorA和FetA分型、16srRNA基因测序）,分型的三个层次,相似度比较（Pairwisesimilarities）种群结构分析（Populationmodelling）遗传进化关系分析（Evolutionarymodelling）,PFGE:,引起两株细菌分型数据不同的遗产事件,MLVA：VNTR位点滑链突变,MLST：管家基因的点突变,大片段的插入、缺失、重组等酶切位点的点突变质粒的获得、丢失,MLST基本原理,细菌染色体,abcZ测序结果,123,222,222,222,DNA提取,管家基因扩增,分离鉴定,标本采集,可靠的序列,MLST分型流程,序列分析,纯菌培养,测序,构树,（1）已分离到细菌：细菌培养，提取DNA。用试剂盒或者水煮法提取均可以。（2）未分离到细菌的标本（脑脊液、血液、咽拭子、肺泡灌洗液等）：用标本直接提取细菌DNA，只能用试剂盒提取。,DNA提取,/neisseria脑膜炎奈瑟菌MLST数据库,.uk/legionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.php嗜肺军团菌SBT（MLST）分型数据库,网站提交获得分型结果,http:/mlst.ucc.ie/沙门氏菌MLST数据库,MLST结果,MLST适合用于长期的、大范围的流行病学调查和监测菌群结构变化，研究地域性传播和流行性变迁。管家基因序列的变化速率慢，多态性相对于其他基因组分更小，目前认为MLST不能单独作为暴发溯源的工具。两株细菌MLST分型结果相同，表示这两株细菌属于相同的克隆或者克隆群，不能认为他们之间有流行病学联系。,2005-2012年234株脑膜炎奈瑟菌MLST分析,MLST应用实例一：脑膜炎奈瑟菌种群结构现状分析,1956-2012年流脑主要血清群流行菌株分子型别变迁,MLST应用实例二：脑膜炎奈瑟菌菌群变迁,MLST应用实例三：环境军团菌菌群结构分析,2005-2012年中国7个城市环境分离164株血清1型嗜肺军团菌种群结构特征,中、日、韩三国环境分离血清1型嗜肺军团菌种群结构特征,MLST应用实例四：霍乱弧菌菌群结构特征分析,160株O1群霍乱弧菌MLST分析最小生成树,160株O1群霍乱弧菌MLST分析Neighbor-joining树,MLST应用实例五：副溶血弧菌菌群结构特征分析,谢谢,无法区分：分离株有相同的带型，包括条带的数目和位置。这些分离株为同一菌株。高度相关：如果PFGE带型仅有因一次基因事件引起的带型变化，这些菌株就被定义为高度相关菌株。这些仅有两到三个条带变化的情况常见于反复传代以及从同一病人中多次分离的菌株。可能相关：PFGE带型与爆发菌株带型变化有两个独立的基因事件引起的条带变化。（通常是4到6个条带的变化）。这些分离株可能是遗传上相关的，但是并不是紧密相关的，其流行病学关系也并不紧密。这样的突变常见于分离自较长的时间段（大于等于6个月）或者是大规模延伸爆发的病人中。无关：三个独立的基因事件引起的条带变化（7个或者是以上的条带变化）。,PFGE结果判读：TENOVER原则,TENOVER原则的前提：菌株是同一暴发期间分离的,关于分型方法使用的建议,暴发调查所有菌株进行PFGE，挑选代表菌株进行MLST；对于细菌特异性引物PCR扩增阳性的标本未能分离菌株的，进行MLST分型。个案调查所有菌株进行PFGE和MLST分型；对于细菌特异性引物PCR扩增阳性的标本未能分离菌株的，进行MLST分型。全国范围的、长期的流行情况调查所有菌株进行PFGE，挑选代表菌株