细胞生物学 09第九章 细胞的增殖和分化 上课

.,第九章细胞的增殖与分化,.,细胞通过增殖增加数量，通过分化增加种类。,200余种、21014个细胞，构造无比复杂。,.,无丝分裂(amitosis)有丝分裂(mitosis)减数分裂(meiosis),第一节细胞分裂,分裂过程中没有染色体组装和纺锤体形成，DNA复制后直接分裂，是低等生物（如细菌）增殖的主要方式。,分裂过程中有纺锤体和染色体的形成。子细胞中遗传物质均等分配。是真核细胞主要的增殖方式。,有性生殖生物形成生殖细胞时的分裂分式。分裂前，染色体复制一次，细胞连续分裂两次，染色体数目减半。,.,一、无丝分裂(amitosis),.,二、有丝分裂(mitosis),.,间期,为了便于描述人为划分,.,M期被细分为六个时期：前期(prophase)；前中期(prometaphase)；中期(metaphase)；后期(anaphase)；末期(telophase)；胞质分裂(cytokinesis):从后期开始延续至末期。,.,染色质凝集成染色体；每条染色体含2姐妹染色单体，以着丝粒相连，至晚前期时外侧形成动粒。核仁分散，逐渐消失。有丝分裂器（纺锤体、星体）形成。,1.前期prophase,(一)有丝分裂各阶段发生的事件,.,中心粒在S期完成复制，在前期移向细胞两极，两个中心体之间形成纺锤体微管；前期末核膜解体时，中心体已到达两极，并形成纺锤体。,.,中心体发出的三种微管结构：极微管（polarmt）动粒微管（kinetochoremt）星体微管（astralmt）,.,有丝分裂器（mitoticapparatus）：动态结构，由微管及微管结合蛋白组成。在中期细胞中包括两部分：纺锤体（spindle）：极微管+动粒微管星体（aster）：星体微管,.,2.前中期prometaphase,始于核膜崩解。纺锤体微管捕获染色体，染色体两侧动粒分别结合来自两侧中心粒的纺锤体微管。染色体剧烈运动，挪向细胞中央。,.,.,3.中期metaphase,染色体排列于赤道板（metaphaseplate）上，姐妹染色单体两侧动粒分别结合于相反的纺锤体极，受力均等。,.,.,4.后期anaphase,姐妹染色单体分开并向两级迁移。极微管不断延长，动粒微管逐渐缩短。细胞两端的纺锤体极（中心体）进一步远离。,.,.,5.末期telophase,子染色体分别到达两极，动粒微管消失。核膜重建。染色质重新疏松，核仁重现。,.,6.胞质分裂cytokinesis,始于后期，止于末期。若核分裂后不发生胞质分裂，则形成多核细胞。,动物细胞-通过胞质收缩环（contractilering）的收缩实现，收缩环由大量平行排列的肌动蛋白与肌球蛋白等组成。形成的结构也称分裂沟（cleavagefurrow）。分裂由外而内。,植物细胞-在细胞中央产生细胞板，与周围细胞壁汇合后将细胞分开。分裂由内而外。,.,.,(二)有丝分裂各阶段发生事件的调节机制,、染色体的凝集黏合素（cohesin）介导染色单体结合；凝集素（condensin）在染色体凝集过程中发挥重要作用。,.,、有丝分裂器的形成与子染色体分离：（）纺锤体的组装（）纺锤体“捕获”染色体,由微管组装和动力（马达）蛋白的共同作用：微管组装与解聚：在（+）端发生聚合和解聚，调节纺锤体微管的长度。微管动力蛋白（马达蛋白）：驱动蛋白（kinesin）向（+）端运动动力蛋白（dynein）向（）端运动-调节极微管之间的滑动、染色体的运动等。,前期中期,.,.,（）染色体的分离机制,后期A：动粒微管（+）解聚缩短，拉动染色体移向两级。动粒处的马达蛋白帮助促进染色体移动。,后期,+,+,+,+,+,+,+,+,.,后期B：极微管（+）端聚合延长，极微管上的马达蛋白促使其互相滑动远离，推动两极更加远离；同时星体微管马达蛋白直接拉动两极更加远离。,+,+,+,+,.,.,、核膜的崩解与再组装机制与核纤层蛋白（lamin）的磷酸化与去磷酸化修饰有关。,Lamin磷酸化,Lamin去磷酸化,核膜小泡融合,染色质疏松,.,、胞质分裂机制、核分裂先于胞质分裂的调控机制1）细胞周期调控系统激活有丝分裂需要的蛋白的同时，使胞质分裂所需要的蛋白失活；2）在形成有功能的收缩环之前不会发生胞质分裂，收缩环的形成需要染色体分至两极后留下的中央纺锤体参与。,.,三、减数分裂(meiosis),产生单倍体配子细胞的分裂方式。,（一）减数分裂的一般过程减数分裂I减数分裂II,同源染色体通过联会实现染色体部分片段的交换，然后分开。,姐妹染色单体分开。,.,.,1、减数分裂I,（1）前期I,.,细线期leptotene,染色质开始凝集，光镜下呈细线状，具有念珠状的染色粒。,.,偶线期zygotene,同源染色体配对-联会（synapsis）。,粗线期pachytene,始于联会完成时，光镜下已能看清姐妹染色单体。同源染色体的非姊妹染色单体间发生交换。,联会复合体二价体四分体,.,每对同源染色体间通过联会复合体（synaptonemalcomplex，SC）结合，称为二价体（bivalent）；含四条姐妹染色单体，称为四分体（tetrad）。,SC,.,电镜下为3条纵带状结构：两边侧生组分，中间中央组分，互相以横纤维相连。SC上有重组小节(recombinationnodules)，含有多种酶，非姐妹染色单体的染色质在此处局部结合，发生DNA交换。SC形成于偶线期，成熟于粗线期，消失于双线期。,联会复合体（synaptonemalcomplex，SC）,.,双线期diplotene,联会复合体消失，同源染色体分离，只有少数点仍连接，称为交叉（chiasmata）。交叉逐渐移向染色体两端，称为端化(terminalization)。,.,双线期RNA合成异常活跃，部分染色体解旋：如两栖类、爬行类、鸟类等卵母细胞中，RNA合成活跃，二阶体解螺旋而形成灯刷染色体。这一时期是卵黄积累的时期。许多动物卵细胞在双线期停留的时间非常长。如人的卵母细胞在五个月胎儿中已达双线期，而一直到排卵期（12-50岁）都停在双线期。,.,终变期diakinesis,染色体再凝集，核仁消失。四分体交叉端化进一步发展，交叉数目减少，通常仅存于端部。纺锤体组装形成。,.,（2）中期I,核膜消失。每条同源染色体上的姐妹染色单体的动粒融合在一起，二价体的两个动粒分别连接于两极的纺锤体微管。二价体端部交叉仍结合在一起。,.,（3）后期I,同源染色体分开，分别向两极移动。同源染色体随机分向两极，染色体上带重组成分。姐妹染色单体仍然相连。,.,（4）末期I,染色体到达两极，多数仍保持凝集状态、或去凝集程度很低。少数细胞发生去凝集。产生的两个子细胞只含单倍数染色体，但含二倍数DNA。,.,2、减数分裂II,分为前期II、中期II、后期II、末期II，过程与有丝分裂相似。一个精母细胞形成4个精子；一个卵母细胞形成一个卵子及2-3个极体。,.,（二）减数分裂的特征和意义,1、DNA复制一次细胞分裂两次,保证人类染色体数目稳定。非同源染色体随机组合，保证物种多样性。,配子种类至少为2n。在人类细胞中n=23,.,减数分裂与有丝分裂比较,.,2、同源染色体的配对与分离,使同源染色体间发生遗传重组，极大增加遗传的多样性。保证同源染色体准确分离。,3、性染色体配对,雄性个体X、Y染色体末端存在一个同源的小区域，可介导二者产生区域配对并交叉互换。,.,（三）异常的减数分裂,产生染色体缺失的单倍体细胞或多拷贝细胞。融合后产生异常胚胎，多数死亡，或发育成疾病成体，如人类的唐氏综合征。减数分裂中的分离错误较易发生于雌性个体，且错误概率随母体年龄增长而增高。,.,第二节细胞周期,一、细胞周期(cellcycle)的基本概念,一个细胞经过一系列生化事件而复制他的组分，然后一分为二，这种周期性的复制和分裂过程。,间期M期,.,.,细胞生长的主要阶段，物质代谢极为活跃，合成大量的RNA和蛋白质等。G1晚期合成DNA复制所需的酶类、以及G1S转变所需的各类蛋白（触发蛋白、钙调蛋白和细胞周期蛋白等）。,G1期是决定细胞增殖状态的关键阶段，G1期进程受多种细胞内外因素影响。G1期长短在不同细胞中差异较大。,1、G1期,二、细胞周期各时相的动态关系与生物大分子的合成,.,从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：,连续分裂细胞：如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。不分裂细胞：指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞。如神经、肌肉、多形核细胞等。静止休眠细胞：暂不分裂、但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞。如淋巴细胞、肝、肾细胞等。,.,2、S期,DNA合成的阶段；组蛋白、非组蛋白等染色质组成蛋白亦在此期合成，并入核与DNA组装成核小体。中心粒也在S期复制。,3、G2期,合成进入M期所需的蛋白质，为细胞分裂作准备。G2期合成的MPF对于M期进入非常关键。,.,成熟促进因子（maturationpromotingfactor,MPF）一种促进M期启动的蛋白激酶，通过促进靶蛋白的磷酸化而改变其生理活性。为异二聚体，由一个催化亚基(p34cdc2,具有激酶活性)和一个调节亚基(细胞周期蛋白B，cyclinB)组成。,.,4、M期,染色体分离及胞质分裂。,.,三、细胞周期的调控,（一）研究细胞周期调控的常用真核细胞系统,1、裂殖酵母与芽殖酵母单细胞真菌，其周期调控过程与人类细胞类似，且增殖迅速，利于研究。,2、爪蟾胚胎细胞受精卵与早期胚胎细胞个体大，含大量细胞分裂所需蛋白质，增殖迅速（几乎无G1与G2期）；且个体大易于操作。,3、体外培养的哺乳动物细胞避免动物体实验的复杂与困难。,.,.,（二）细胞周期调控系统的组成,可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。其活性受到cyclin的调节，必须与cyclin结合才能被激活。Cdk活性的周期性改变，启动或调节DNA复制，有丝分裂、胞质分裂等细胞周期主要事件。目前已知Cdk家族成员有Cdk1（cdc2）、Cdk2、Cdk3Cdk9。,1、细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶,Cdk(cyclin-dependentkinase)细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶,.,是一类蛋白激酶，但必须与cyclin结合并且特定的氨基酸残基处于合适的磷酸化状态后才可能具有激酶活性。通过磷酸化多种与细胞周期相关的蛋白，在细胞周期调控中起关键作用在细胞周期的不同阶段，不同的CDK分子被激活，由此引发或调控细胞周期的主要事件,.,（2）Cyclin（细胞周期蛋白）,在每一个细胞周期都经历了合成和降解的循环过程，含量呈周期性变化。在脊椎动物中已知有cyclinA、B、C、D、E、F、G、H、T等，都有周期蛋白框（cyclinbox）。Cyclin不仅能与特定Cdk结合而使其活化，而且还“指引”Cdk到达特定的靶蛋白，从而诱导特定细胞周期事件的发生。分为类：G1、G1/S型、S型、M型。,.,表3-9-1主要的cyclin和Cdk,*CyclinD包括D1-3，各亚型cyclinD在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,.,脊椎动物细胞周期调控系统主要成员,CyclinB+Cdk1,.,（3）Cdk活化激酶与Cdk活性抑制因子,Cdk活化激酶（Cdkactivatingkinase,CAK）：一种蛋白复合物，磷酸化Cdk，使之激活。,Cdk活性抑制因子,Cdk抑制激酶,Cdk抑制蛋白（Cdkinhibitor,CKI）,.,激酶Kinase:addP-磷酸化,磷酸酶Phosphatase:removeP-去磷酸化,Cdk抑制激酶,.,Cdk抑制蛋白（Cdkinhibitor,CKI）,包括：CIP/KIP：P21cip1、P27kip1、P57kip2。INK4:P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d。,与Cdk/cyclin复合物结合，抑制Cdk的活性，对细胞周期起负调控作用。,.,（4）促进Cdk调节因子降解的酶复合物,泛素（ubiquitin）-蛋白水解酶复合物（proteasome）通路,Cdk调节蛋白的降解主要依赖两种复合物：SCF和APC。需要降解的蛋白质，在特定Aa上被连上一串泛素。结合了泛素的蛋白质被蛋白水解酶复合物识别并且降解，这是细胞内蛋白质降解的普遍途径。,降解的蛋白质,泛素链,.,.,.,Cdk活性的调节方式,Cyclin的结合,Cdk上特定位点的磷酸化状态,CKI的结合,Cdk调节因子的降解,细胞周期的运转就是细胞周期调控系统的关键蛋白cdk激酶被激活或失活的过程。,.,2，细胞周期检查点（cellcyclecheckpoint）,为保证染色体数目的完整性及细胞周期正常运转，细胞中存在着一系列监控系统，可对细胞发生的重要事件及出现的故障加以检测，只有当这些事件完成，故障修复后，才允许细胞周期进一步运行，该检测系统即为检查点。,.,.,G1检查点：存在于G1晚期，酵母细胞中称启动点（start），哺乳动物细胞称R点，越过R点可完成有丝分裂。G2或G2/M检查点：控制细胞是否进入M期。中期检查点（纺锤体组装检查点）：若有染色体未正确附着于纺锤体上，染色体分离将延迟。DNA复制检查点：发生于G2/M转换过程中，检查DNA复制是否完成或有否发生错误。DNA损伤检查点：发生于G1期和G2期，识别DNA受到损伤时的错误碱基并且将之修复，防止错误碱基被复制。,.,.,检查点的化学本质细胞周期调控系统的组成分子被激活或失活，尤其是细胞周期调控系统的关键蛋白激酶被激活或失活的信号传导过程。,.,（三）细胞周期事件的调控,.,（三）细胞周期事件的调控,M期的进入（P239）,无活性,无活性,活化,间期（G2）,M期,Cdk活化激酶（CAK）,活化性磷酸化,抑制性磷酸化,P,P,P,无活性的磷酸酶,Cdk抑制激酶（Wee1）,.,MPF的活化和失活,G1,S,G2,M,CDK1,MPFactivity,.,G1期的调控（P241）,cyclin与G1-Cdk的结合-激活Cdk。CKI与Cdk/cyclin复合体的结合-抑制Cdk活性。,Rb蛋白（人视网膜母细胞瘤蛋白）的“刹车”作用,活化的G1-Cdk,S期基因转录,活化,失活,.,DNA损伤与p53蛋白对细胞周期进程的阻抑作用(P241),辐射与化学物质等可能导致DNA损伤。,有两个DNA损伤检查点：G2期，损伤修复机制使cdc25磷酸化失去活性，抑制M-Cdk的活性，阻止细胞进入M期。G1期，损伤修复机制使p53被磷酸化而激活，p53作为转录因子，导致CKIp21的表达，p21结合G1/S-Cdk和S-Cdk抑制它们的活性，从而阻止细胞进入S期。,.,.,（四）癌基因和抑癌基因在细胞周期调控中的作用,癌基因（原癌基因）：存在于脊椎动物细胞中与病毒癌基因相似的基因。正常细胞中少量表达，为细胞生长和增殖所必需的，但是突变或过量表达导致细胞恶性增殖。如Ras和Myc。抑癌基因：与癌基因相反，还有一类存在于正常细胞中的，能抑制细胞恶性增殖的基因。这些基因编码的产物，从多个调控点参与对细胞周期的调控，缺失或失活引起癌变。如p53和Rb。,.,以原癌基因为代表推动细胞周期进程的正的调控作用。以抑癌基因为代表的抑制细胞周期的负的调控作用。两者之间的平衡维持了细胞正常的生长增殖状态。,.,有丝分裂原：能促进细胞增殖的生长因子，已发现50多种。如表皮生长因子EGF、红细胞生成素、血小板生长因子等。信号通路：ras途径，cAMP途径、磷脂酰肌醇途径。,（五）细胞周期的胞外调控因素,.,四、细胞周期时相的测定和细胞的同步化,（一）细胞周期时相的测定,、掺入标记法：标记物：3H-TdR（H3标记的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷）、或BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）。细胞在含标记物的培养基中培养，标记物可在S期掺入新合成的DNA链中，从而标记处于S期的细胞。通过检测3H的放射性或BrdU抗体的荧光强度衡量不同时相的细胞数量及比例。,.,2、流式细胞分光光度法：原理：细胞的DNA经荧光染色逐个通过流式细胞仪检测装置记录每个细胞的荧光强度荧光强度与DNA含量呈正比。,G2期、M期DNA含量是G1期细胞二倍；S期细胞DNA含量介于两者之间；根据仪器读出G1期、S期、G2+M期的细胞数确定各时相的长度。,.,（二）细胞的同步化（synchronizationofcell）,使处于周期不同阶段的细胞共同进入某一特定阶段。,1、有丝分裂摇落法体外培养的贴壁细胞，处于M期时缩起变圆，易从贴附介质脱落。因此可借振摇之力使M期细胞悬浮于培养基中，通过离心收集得到。,2、活细胞离心淘洗法处于周期不同时相的细胞体积不同，在离心场中沉降速度有别。因此利用离心淘洗方法可将细胞按比重分离，得到不同时相的细胞。,.,3、化学同步化法利用药物诱导细胞同步化在某一时期。常用的有DNA合成阻断及有丝分裂中期阻断。,（1）DNA合成阻断法应用DNA抑制剂阻断S期细胞的DNA合成，可获得大量同步于S期的细胞。如甲氨喋呤、羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、过量TdR等。,（2）有丝分裂中期阻断法通过抑制微管的聚合，使细胞阻断在有丝分裂中期，从而得到M期细胞。如秋水仙素、N2O等。,.,第三节细胞分化,细胞分化(celldifferentiation）：从受精开始的个体发育过程中，同源细胞之间在形态、结构和功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性转录表达的结果。,一、细胞分化的基本概念,.,细胞分化的特征：,分化相对稳定。2.分化差异的确定早于形态差异的出现。细胞决定（determination）：细胞从分化方向确定到出现特定的形态之前的时期称为决定。细胞决定即意味着细胞内部已发生了稳定的变化，基因活动模式已开始发生改变，确定了未来的发育命运。,.,3.细胞生理状态随分化水平提高而变化。如：高度分化细胞的分裂能力多数下降；高度分化细胞对电离辐射的敏感度比分化程度低的细胞低。4.分化具有时空差异。在时间上：一个细胞在不同的发育阶段可以有不同的形态和功能。在空间上：同一种细胞的后代，环境不同可以有相异的形态和功能。,.,二、细胞分化的潜能,在发育过程中细胞分化潜能逐渐变窄,全能细胞（totipotentcell）：受精卵到囊胚前的胚胎细胞，能够分化出机体各种细胞、组织与器官，发育成一个完整的个体。多能细胞（pluripotentcell）：三胚层期的细胞等，具有发育成多种组织的潜能，但失去了发育为完整机体的能力。稳定型单能细胞（unipotentcell）：只能分裂分化产生一种类型的细胞。,.,分化发育进程：全能性多能性单能性成熟定型,.,2.分化细胞细胞核的全能性,分化细胞仍然具有与受精卵一样的全部基因组，具备该生物的全部遗传信息-即高度分化的体细胞核仍然具有发育全能性。,Dolly（多莉）的克隆成功是对此的有力证明。,.,.,三、细胞分化与基因表达,管家基因（house-keepinggene）：维持细胞生存所必需的基因，在各种细胞中均处于活动状态。例如，核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖酵解酶等。对细胞分化只有协助作用。奢侈基因（luxurygene）/组织特异性基因：在不同组织中有不同的选择表达。例如，血红蛋白、角蛋白、胰岛素等。与各种分化细胞的特殊性状有直接关系。,.,1、转录水平的调节,顺式作用元件：包括启动子、增强子、沉默子反式作用因子（转录因子）：,通用（基本）转录因子：结合启动子TATA框，参与转录启动。特定转录因子：与特定顺式作用元件结合，调节特定基因的转录。转录激活因子：多为增强子结合蛋白；转录抑制因子：多为沉默子结合蛋白，或通过结合激活因子等抑制基因的表达。,.,eg.血红蛋白由4条珠蛋白肽链构成，在发育过程中，不同类型的珠蛋白依次出现和消失，这是转录水平上基因差异性表达的结果。,.,DNA甲基化：阻碍转录因子结合，从而阻抑转录的活性。甲基化程度越高，DNA转录活性越低。,.,2、转录后的加工调节（mRNA）,选择性将mRNA移出细胞核。通过选择性剪接在不同细胞