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DNA限制性内切酶酶切与电泳,分子生物学实验技术,重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室刘先俊,实验目的掌握DNA酶切的基本原理。学习和了解限制性内切酶的使用方法。学习和了解DNA琼脂糖凝胶电泳的方法,实验原理,一、限制性内切酶概念是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是基因工程的重要工具。这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来的侵袭。,型酶就是通常指的限制性内切酶.它们能识别双链的特异顺序（回文序列），并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。,5-GAATTC-33-CTTAAG-5,5-GTTAAC-33-CAATTG-5,EcoR的识别序列,Hae的识别序列,5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN33NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5,5NNNNNG3NNNNNCTTAAp,EcoR的识别序列和酶切切口（粘端）,pAATTCNNNNNN3GNNNNNN5,5NNNNNNGTTAACNNNNN33NNNNNNCAATTGNNNNN5,5NNNNNGTTpAACNNNNN33NNNNNCAApTTGNNNNN5,Hae的识别序列和酶切切口（平端）,酶切反应中应注意以下几个问题,内切酶：2.DNA反应缓冲液酶解温度与时间,二、DNA琼脂糖凝胶电泳,原理：琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛效应分离不同分子量大小的DNA，相同分子量的DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵敏。,溴化乙锭为荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线254365nm照射下呈桔红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.51g.,线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系,实验方法,一、酶切按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。DNAg10buffer2.5l无菌水内切酶2总体积：25l,将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。Eppendorf管封上封口膜于水管中反应小时。反应结束后加入EDTA至终浓度10mM终止反应。取l反应液加lLoadingbuffer混匀于琼脂糖凝胶上伏电泳小时。紫外透射仪上检查实验结果。,二、电泳,琼脂糖溶液的制备溴化乙锭浓度0.5
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