第1章-微生物药物产生菌.ppt

微生物制药,吴剑波主编,分离微生物,筛选方法的建立,微生物分类学,抗生素发酵（选用不同培养基及培养条件）,筛选（采用微生物学、生物化学、生物学或化学方法等进行测定）,早期鉴别,化合物的分离与纯化,理化性质及生物学性质的测定,采集样品,新物质,临床前药理,临床试验,开发研究,生物合成作用机制耐药机制,全合成结构改造,结构测定,可能为新物质,毒性低，疗效好,阳性样品,全发酵液、上清液或菌丝体浸泡液（或粗提品等）,新微生物药物的筛选流程,第1章微生物药物的产生菌,药物的产生菌；新药产生菌的分离；新微生物药物的筛选。,1.1微生物药物的产生菌,主要包括放线菌、真细菌和丝状真菌等。1、放线菌应用于临床的微生物药物大部分来源于放线菌的次级代谢产物。放线菌产生的抗菌药物中化学类别较多。,（1）放线菌产生的抗菌药物,-内酰胺类氨基糖苷类大环内酯类四环素类紫霉素类糖肽类多烯类其他抗细菌抗生素,产生-内酰胺类抗生素的放线菌,产生氨基糖苷类抗生素的放线菌,具有广谱的抗细菌活性。作用于细菌的蛋白质合成。产生菌均为链霉菌。,大环内酯类抗生素的产生菌均为链霉菌。主要抗G+细菌，对军团菌、支原体、衣原体有抗菌作用。阻断蛋白质的合成。,多烯类抗生素产生菌主要是链霉菌，作用于真菌，能与真菌细胞膜中的固醇结合，使膜受损，影响细胞正常代谢，导致细胞死亡。,产生多烯类抗生素的放线菌,产生其他抗细菌抗生素的放线菌,蒽环类糖肽类色霉素类烯二炔类丝裂烷类其他抗肿瘤抗生素,（2）放线菌产生的抗肿瘤药物,蒽环类抗生素产生菌,以发色团插入DNA双螺旋中而与DNA结合，抑制依赖于DNA的RNA多聚酶，抑制RNA合成和DNA复制,糖肽类抗生素产生菌,与DNA结合，使DNA单链断裂，抑制胸腺嘧啶进入DNA中，终止癌细胞的分裂,其他抗肿瘤抗生素,（3）其他药物产生菌,2、细菌,真菌是第一个应用于临床的抗生素青霉素的产生菌，并从此进入了抗菌治疗中的抗生素时代。,3、真菌,4、其他药物产生菌,天然青霉素,二新药产生菌的分离,（一）土壤微生物的分离,土壤是微生物的重要栖息地。,1.采集样品2.分离微生物3.选留菌种及保存,分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。土壤样品通常采表层土（5cm以下），样品以未开垦过的土壤为佳，要尽可能选择不同地理和生态环境的土壤。,2.分离微生物,样品的处理分离培养基抑制剂的使用分离方法培养条件稀有放线菌的选择性分离其他微生物的分离,（1）样品的处理,利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线菌孢子间的耐性差异，用物理或化学的方法除去细菌及目的外放线菌，或者用花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分出率。,温度-分离前样品加热处理,化学试剂的处理,SDS-酵母膏处理法，SDS对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌数明显减少。风干的土壤与CaCO3混合后在26培养79d，然后分离放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，CaCO3有利于放线菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。用0.01mol/LNaOH处理土壤510min（15）可减少细菌的数量，有利于分离小单孢菌。用1.4%酚处理土样10min或用1.4%酚130处理30min，分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。用乙酸乙酯或氯仿和苯处理样品，过滤风干后用来分离微生物，可以除去样品中的真菌。,物理方法的处理,离心，1600g离心20min，上清液主要有放线菌孢子，沉淀含有细菌和真菌孢子。超声波处理，分离小单孢菌和链霉菌。特殊器具捕集空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。搅动，使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。膜过滤，将水经膜（孔径0.45um滤膜）过滤，浓缩水中微生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。诱饵法，在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发等，可分离小瓶菌和发仙菌。,（2）分离培养基,总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都生长出来，而其他微生物（细菌和真菌）又尽可能不长。合成培养基精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天门冬素培养基，察氏培养基等有机培养基Waksman培养基，Bennett培养基几丁质培养基只有放线菌能够利用几丁质，生长的菌落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区分HV培养基以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基,选择性分离放线菌所使用的培养基,（3）抑制剂的使用,加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rosebengal等），抑制真菌生长；加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌的分出率；加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。,（4）分离方法,稀释法最常用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。干土喷射法用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直接喷在分离平板上。孢子飞扬法将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置一个分离平板，剧烈振荡使孢子飞扬，撞到分离平板上进行分离培养。滤膜法将0.220.45um的滤膜放在分离平板上，接种菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入培养基的放线菌经继续培养后长出菌落。,（5）培养条件,一般培养温度为2530，也有3237，培养714d，生长慢的放线菌可延长培养1个月；分离高温放线菌用4550培养12d；海水放线菌用20培养6周左右。,（6）稀有放线菌的选择性分离,稀有放线菌的特征：生长速度比较缓慢；营养需求较为复杂；比较缺乏孢子分化的能力；不能稳定保存。,分离几种稀有放线菌的方法,分离几种稀有放线菌的方法,分离几种稀有放线菌的方法,分离几种稀有放线菌的方法,分离几种稀有放线菌的方法,分离几种稀有放线菌的方法,其他微生物的分离,3.选留菌种及保存,将菌株的优良特性保存下来，保持微生物的活力。低温保藏法传代培养保藏法液体石蜡保藏法沙土保藏法冷冻干燥保藏法,（二）海洋微生物的分离,Okami等从海洋中分离放线菌的程序,（3）普通分离放线菌培养基适当稀释，再加入人造海水,分离海洋放线菌的培养基,（1）SC培养基：,（2）Z培养基：,（三）极端微生物的分离,极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高碱、高压等）中形成的一类特殊的微生物，因而在分离这类微生物时，需考虑它们生长繁殖所需的特殊条件，以设计分离与培养条件。分离嗜热微生物，有些菌株的最适生长温度高达80，pH在1-6；分离嗜盐微生物时培养基中的盐浓度可高达2.5mol/L。,粘细菌,基因重组微生物利用基因工程技术构建产生新的次级代谢产物的基因重组微生物，逐步创立组合生物合成。利用基因重组微生物提高已有抗生素的产量和有效组分的含量。,纤维素堆囊菌（Sorangiumcellulosum）大环内酯类抗生素堆囊菌素，琥苍菌素（抗真菌）,（四）其他微生物资源,组合生物合成将产生不同抗菌药物或其他生理活性中间体的基因重组到一种微生物中，使其生物合成途径重新组合，生产迄今自然界还没有的新的抗生素或生理活性化合物。,（五）难培养微生物的分离与培养研究,VBNC（viablebutnonculturable）指那些可培养的不分化的微生物在受到外界压力刺激后，通过一系列的类似分化的遗传程序而使自身处于一种能抵抗饥饿和压力的状态；尽管此后不能用常规的培养方法恢复其生长繁殖，但实验证明它们仍保持生存力与致病因子和/或基因。,三.新微生物药物的筛选,（一）初筛发酵初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。,培养基成分,培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料,初筛方式,固体平板发酵便于大量筛选抗菌物质时采用。液体振荡培养放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。,（二）筛选模型的研究与应用,10000株新分离的放线菌,30株（可能是新抗生素）,10种新化合物,1种有希望的化合物，低毒性，体内有效,新抗生素/分离的菌株数：1/1000新抗生素/已知抗生素：1/50有希望的抗生素/分离的菌株数：1/10000,2500株对细菌有抗菌活性,500株,250株链丝菌素类125株链霉素类40株四环素类55株其他已知抗生素,交叉耐药试验和纸层鉴别,Woodruff等的经典筛选,毒性试验,1.常规的筛选方法,琼脂扩散法利用多种微生物作为检定菌，筛选有抗菌活性的物质。,非致病菌抗生素耐药突变株和超敏菌株厌氧菌协同活性检测,以作用机理为依据的筛选方法以耐药机制为依据的筛选方法,2.定靶筛选,从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。,（1）以作用机理为依据的筛选方法,细菌细胞壁合成抑制剂的筛选；细菌叶酸代谢抑制剂的筛选；蛋白质合成抑制剂的筛选；细菌DNA回旋酶抑制剂的筛选；改变细胞膜通透性药物的筛选；作用于细菌外膜的药物的筛选；作用于细菌外排泵的药物的筛选；作用于非甲羟戊酸生物合成途径的筛选；氨基糖苷类抗生素的筛选,细菌细胞壁合成抑制剂的筛选,土壤分离的微生物（10200株）（细菌、真菌和放线菌）,第二步：测定抑制同位素渗入meso-3H二氨基庚二酸L-14C亮氨酸,用DiafloUM-2膜测定相对分子质量（1000以下）,小分子量：azureomycinA和B（新）AM-1034AM-5289Amphomycin，青霉素G大分子量：ristocetinA和B其他（11种）,第一步：抗微生物活性：细菌支原体,细胞壁合成抑制剂（141）,asukamycinSetomimycinvineomycins,nanaomycinA、B、C、D、EfreonolicinBcervinomycins,其他,（2）以耐药机制为依据的筛选方法,抗生素的广泛使用和一些不合理的滥用，引起细菌耐药性的增加，而细菌耐药机制的研究进展又使耐药性的解决成为可能。,（2）以耐药机制为依据的筛选方法,耐药机制一是细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性；二是抗生素的作用靶点由于发生突变或被细菌的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗生素作用的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降；三是由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改变；四是细菌具有一种依赖于能量的主动外排机制。,筛选方法,-内酰胺酶抑制剂的筛选：a.耐药菌株平板法；b.液体测定法；c.联合使用-内酰胺酶以及敏感和耐药菌株；d.通过颜色变化来检测-内酰胺酶抑制剂；e.诱导-内酰胺酶方法的应用f.肾二肽酶抑制剂的筛选氨基环醇类抗生素钝化酶抑制剂的筛选氯霉素乙酰转移酶抑制剂的筛选,-内酰胺酶抑制剂的筛选,-内酰胺酶是一类能够破坏具有-内酰胺结构抗生素的钝化酶的总称。许多致病菌由于产生-内酰胺酶而对青霉素和头孢菌素具有抗性。-内酰胺酶抑制剂的筛选主要依据抑制剂抑制-内酰胺酶，使酶失去活性，不能水解-内酰胺类抗生素，使抗生素保持生物活性，从而抑制细菌生长繁殖。,a耐药菌株平板法,10ug/ml青霉素G,涂布青霉素耐药菌,d通过颜色变化检测-内酰