干扰实验评价

1/22干扰实验评价ICS点击此处添加中国标准文献分类号WSWS/TXXXXXXXXX中华人民共和国卫生行业标准干扰实验准则GUIDETOINTERFERENCETESTINGINCLINICALCHEMISTRY点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXXXXXX发布XXXXXXXX实施目次前言II引言III1范围12规范性引用文件13实验室安全14术语和定义2/2215干扰实验方案2干扰物对检测结果的影响2干扰标准及被测量与干扰物实验浓度的确定3对实验操作人员的要求4对检测系统的要求4干扰物筛查实验5干扰物剂量效应评价实验86干扰实验报告11附录A附录A常见生化项目质量指标12附录B附录B常见被测量的建议实验浓度13附录C附录C常见内源性干扰物的建议实验浓度3/2216附录D附录D干扰筛查实验结果记录表18附录E附录E干扰剂量效应实验结果记录表19参考文献20前言本准则根据我国卫生部颁发的临床实验室管理办法的要求，参考有关文献并结合我国实际情况起草。本准则中附录A、B、C、D、E为资料性附录。本准则由卫生标准管理委员会全国临床检验标准委员会归口。本准则起草单位卫生部临床检验中心。本准则主要起草人汪静，陈文祥，赵海舰，谢洁红，王冬环，申子瑜本准则于20XX年XX月首次发布。本准则由卫生部临检中心负责解释。引言干扰是引起临床实验室测定误差的重要原因之一，无论是定性还是定量方法均可受到干扰物质的影响。某些情况下，因干扰所致的结果误差可能影响医生的临床决定，4/22给医患双方带来不利影响。临床实验室可通过室内质控对检测系统的精密度进行监测，通过与参考物质或参考测量程序的测定值相比较以验证结果的准确性，但对因干扰所致的偏差却较难控制。本准则可帮助生产厂家与临床实验室在满足临床需求的背景下对干扰物质进行评价，明确具有临床意义的误差来源。本准则起草过程中参考有关文献并结合我国临床实验室的实际情况，详细描述干扰实验评价方案并提出如何判断干扰标准的具体方法，在干扰物质剂量效应评价时采用更易理解的统计学方法进行线性判断。附录中给出了有关常见生化项目质量指标、常见被测量建议实验浓度、常见内源性干扰物建议实验浓度等内容，并对结果记录表格进行规范，适用于我国临床实验室与生产厂家对临床生化检测系统进行干扰评价。干扰实验准则1范围本准则适用于体外诊断医学设备厂商与临床实验室，向厂家与实验室提供科学有效的干扰实验设计，阐明数据分析方法及结果解释，使厂家可以评价可能存在的干扰影响并向用户提供相关干扰报吿，实验室可对检测系统的特异性参数进行验证。本准则主要用于对常规临床实验室定量方法进行干5/22扰评价，所用样本类型包括血清、血浆、脑脊液、尿液及其他体液。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。JF10011998通用计量术语和定义JCGM200XX国际计量术语医疗机构临床实验室管理办法病原微生物实验室生物安全管理条例病原微生物实验室生物安全环境管理办法医疗废物集中处置技术规范医疗卫生机构医疗废物管理办法3实验室安全干扰评价实验中使用的所有样品均应按感染性物质处理。正确处理实验室废弃物、实验人员防护及实验室环境应符合国家相应法规要求，具体措施可参见病原微生物实验室生物安全管理条例、病原微生物实验室生物安全环境管理办法、医疗废物集中处置技术规范、医疗卫生机构医疗废物管理办法等。4术语和定义下列术语和定义适用于本准则。6/22干扰INTERFERENCE在临床化学中，被测物浓度因样品特性或其它成分的影响而出现的临床显著性偏差。这种影响可见于检测系统的非特异性、指示反应响应不佳、被测物活性抑制等情况。注分析前影响虽也可使被测物浓度产生临床显著性偏差，但不属于分析干扰。干扰物INTERFERINGSUBSTANCERNA干扰实验一、磷酸钙转染法【实验原理】磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。【仪器、材料和试剂】仪器、用具CO2培养箱、10CM细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ML锥形管、烧杯、量筒等。7/22材料呈指数生长的真核细胞BALB/C3T3CSCL纯化的表达质粒DNA试剂1完全培养液DMEM90MLFCS10ML22MCACL2，过滤除菌，20保存备用32HEBSNACLKCLHEPES葡萄糖用NAOH调PH至，过滤除菌后，20保存备用。【方法与步骤】1在10CM的培养板上接种1106个BALB/C3T3细胞第二天进行转染2准备CAPO4沉淀准备两组试管8/22在A管中加入15G质粒DNA69L2MCACL2460L重蒸水在B管中加入550L2HEBS用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续12MIN。室温静置30MIN，出现细小颗粒沉淀。3小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10CM平板中，轻轻晃动。4在5CO2的加湿培养箱中培养细胞26HR。5除去培养液，加入10ML完全培养液培养细胞16天。6收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。【注意事项】1在整个转染过程中要保持无菌操作。2在实验中使用的各种试剂都必须小心校准，保证质量。3质粒DNA需CSCL纯化，乙醇沉淀后的DNA应保持无菌，在无菌水或TRISEDTA中溶解。4沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至9/22关重要。在磷酸盐溶液中加入DNACACL2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地黏附和进入细胞。二、电穿孔和电融合技术实验原理当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法，把各种外源物质引入活细胞。与其他常用的导入外源物质的方法相比，电穿孔具有很多优点。首先，不必象显微镜那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。实际上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。除了能使细胞膜具有通透性，让外界的分子扩散入胞液中以外，高强度的电场脉冲也能引起细胞融合，这一现象叫做电融合。然而，在用电脉冲融合前必须使细胞相10/22互紧密接触，这一电融合方法在原生质融合制取杂交植物，胚胎细胞相互融合制备动物克隆方面非常有用，尤其在制取杂交瘤细胞制备单克隆抗体方面用处很大。几个实验室已证明使用电场电融合效率比常规的化学融合方法高10到100倍，最近，贴壁细胞的电融合还被用来研究细胞融合时细胞的骨架成分和细胞器的动力学重排。仪器、材料和试剂仪器脉冲发生器，样品池一个盛细胞的容器和两个平行的金属电极，CO2培养箱，离心机，显微镜，微量移液器，镊子，剪刀，三角瓶，吸管，毛细管，离心管等。材料试剂穿孔介质15MMOL/L磷酸钾1MMOL/LMGCL2250MMOL/L蔗糖10MMOL/LHEPES调节PH至融合介质1MMOL/LMGCL2280MMOL/L甘露醇2MMOL/LHEPES调节PH至方法与步骤一悬浮细胞的电穿孔法1电穿孔进行基因转移11/22电穿孔可用于将多种不同类型的分子载入活细胞中，操作步骤非常相似。以下我们用基因转移作为例子。载入其他的分子可按以下相同步骤进行，只需把外源DNA换页所需分子即可。使细胞在适宜的培养基中生长，用胰酶处理，收获对数生长中期的细胞，并用腺酶处理。在穿孔介质中至少洗一次。洗细胞时，在台式离心机上1000RPM离心3分钟，使得悬浮细胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介质中重新悬浮细胞。计数细胞，在PM中，浓缩细胞为大约1千万细胞/ML。将DNA加到细胞悬液中，充分混合，使DNA均匀分散，用吸管吸一定体积的细胞DNA混合液到装有电极的灭菌小样品池中。在电穿孔装置上设置输出电压和脉冲宽度。假如设备是CD脉冲型发生器，设定电容和并联电阻，以达到合适的值。将小池放进盛样品的池中，启动电穿孔装置，供给所需的电脉冲。电处理后，向小池加1ML普通培养基，将细胞混合液从小池转移到组织培养容器中，再加入一些培养基使最终的培养基体积适量。然后，将样品细胞放回孵育箱中12/22使之在正常条件下生长。在测定转移基因的表达量前电穿孔细胞各自培养的时间不同。2检测电穿孔效率和细胞存活率除用罗丹明偶联葡聚糖代替DNA外，将罗丹明偶联葡聚糖引入目标细胞的方法如前所述。电穿孔后，用培养基洗涤细胞两次，去掉胞外的荧光葡聚糖。电穿孔后30MIN，向细胞悬液中加30L台盼蓝，孵育2MIN，然后用培养基洗涤。在1000RPM下离心3MIN，收集细胞，将细胞重悬于PM中，终体积100L。将一滴细胞液置于干净载玻片上，用盖玻片盖好，在显微镜下检测细胞，测定摄取荧光标记葡聚糖的百分数。在亮视野镜片下，死细胞可因染成蓝色检测出，测定细胞存活的百分数。在各种电场设定值下重复实验，画出摄取葡聚糖率和细胞存活率对电穿孔参数的曲线。这一曲线就将显示对特定细胞类型电穿孔的最优条件。分析干扰试验一分析的干扰13/22分析的干扰广义上是指某一物质对某分析物的浓度或催化活力测定中任何一步骤的影响作用称为分析干扰。很难区分清楚2个相互很近的词义“干扰”和“固有的特异性欠缺”。分析物是标本中准备测定的组分。干扰物也是标本中的一个组分，它不是被分析物，但它改变最后的结果。干扰作用可看成是绝对的或相对的，绝对干扰作用是一般病人标本中不含有某物质，一旦它的存在即会引起干扰。相对干扰作用一般病人标本中含有某物质，其含量相当于混合样品中的平均浓度，不同病人样品中含该物质的浓度变化引起干扰作用的变化。从实用考虑相对的内容在临床实验中更有意义。例如在标本中含有120G/L蛋白和正常标本含有70G/L相比较确定蛋白会引起干扰。这样，纯粹的干扰作用是50G/L而不是120G/L蛋白。在正常血清的基体中70G/L蛋白的作用是恒定的，相对于真正的分析物是系统的方法偏倚。常以空白测定和样品的预处理来消除这样的干扰所产生的恒定偏倚。用含有血清的校准品作校准及计算补偿因子也是用来消除这类系统偏倚。干扰不涉及在分析前就使分析物浓度发生真实变化的作用，这些作用可以是体内药物作用。标本处理。标本收集例如在静脉滴注时取样。14/22这些作用可能会影响实验结果的临床应用，但不能视作“分析干扰”。因为不管分析物原来如何，一个检测系统或分析方法应检测标本中所有的分析物。分析干扰所引起最终结果是人为的增加或减少。二干扰物质的来源在标本中的干扰物可分成内源性和外源性；1体内某些病理条件下产生的；2在病人治疗时摄入的；3自我摄入；4由于标本被污染；三干扰的机理由于某干扰物的存在以多种方式影响分析过程。1物理作用干扰物具有的物理性质，使它和分析物一样被检测和测定出来。如它的颜色、光散射、洗脱位置、电极响应等。干扰物可能会改变标本的物理特性如表面张力、粘度、浊度、离子强度等，干扰检测结果。2化学作用干扰物可能会影响酶活力，例如阻止金属激活剂结合到活性中心上去，氧化必须的巯基等；干扰物也可破坏或阻止反应，例如破坏试剂或抑止指示反应。15/22干扰物也可改变分析物的形式，例如形成复合物或沉淀。3非特异性干扰物可能和分析物以同样的方式参与反应，例如苦味酸肌酐方法中酮酸干扰，重氮胆红素方法中吲哚酚硫酸盐的干扰。在免疫化学方法中干扰物可能和抗体发生交叉反应。例如茶碱方法中咖啡因的干扰。干扰物可能催化某一反应，反应结果中和了底物。例如腺苷激酶可在CK反应中消耗底物ADP。4水取代作用非水物质，由于取代了血浆中部分水体积，影响了一些分析物的测定。这些作用考虑或不考虑为干扰作用，取决于要求的结果是以总体积的浓度表示，还是以血浆水的浓度来表示。临床要求较之分析原理更重要，须确定是否考虑取代作用是一个干扰，例如用火焰光度法或间接电位法作NA测定时，高脂血症被考虑为是一种干扰。因为NA在血浆水中的浓度在临床上有重要意义。我们是用一检测范围内血样，不含干扰物，作为对照样本，再分别加入不同浓度的干扰物，同时检测，分别计算相对对照样本的相对偏差，不超过标准的要求就是可接受的干扰物浓度。16/22一分析的干扰分析干扰试验分析的干扰广义上是指某一物质对某分析物的浓度或催化活力测定中任何一步骤的影响作用称为分析干扰。很难区分清楚2个相互很近的词义“干扰”和“固有的特异性欠缺”。分析物是标本中准备测定的组分。干扰物也是标本中的一个组分，它不是被分析物，但它改变最后的结果。干扰作用可看成是绝对的或相对的，绝对干扰作用是一般病人标本中不含有某物质，一旦它的存在即会引起干扰。相对干扰作用一般病人标本中含有某物质，其含量相当于混合样品中的平均浓度，不同病人样品中含该物质的浓度变化引起干扰作用的变化。从实用考虑相对的内容在临床实验中更有意义。例如在标本中含有120G/L蛋白和正常标本含有70G/L相比较确定蛋白会引起干扰。这样，纯粹的干扰作用是50G/L而不是120G/L蛋白。在正常血清的基体中70G/L蛋白的作用是恒定的，相对于真正的分析物是系统的方法偏倚。常以空白测定和样品的预处理来消除这样的干扰所产生的恒定偏倚。用含有血清的校准品作校准及计算补偿因子也是用来消除这类系统偏倚。干扰不涉及在分析前就使分析物浓度发生真实变化的作用，这些作用可以是17/22体内药物作用。标本处理。标本收集例如在静脉滴注时取样。这些作用可能会影响实验结果的临床应用，但不能视作“分析干扰”。因为不管分析物原来如何，一个检测系统或分析方法应检测标本中所有的分析物。分析干扰所引起最终结果是人为的增加或减少。二干扰物质的来源在标本中的干扰物可分成内源性和外源性；1体内某些病理条件下产生的；2在病人治疗时摄入的；3自我摄入；4由于标本被污染；三干扰的机理由于某干扰物的存在以多种方式影响分析过程。1物理作用干扰物具有的物理性质，使它和分析物一样被检测和测定出来。如它的颜色、光散射、洗脱位置、电极响应等。干扰物可能会改变标本的物理特性如表面张力、粘度、浊度、离子强度等，干扰检测结果。2化学作用18/22干扰物可能会影响酶活力，例如阻止金属激活剂结合到活性中心上去，氧化必须的巯基等；干扰物也可破坏或阻止反应，例如破坏试剂或抑止指示反应。干扰物也可改变分析物的形式，例如形成复合物或沉淀。3非特异性干扰物可能和分析物以同样的方式参与反应，例如苦味酸肌酐方法中酮酸干扰，重氮胆红素方法中吲哚酚硫酸盐的干扰。在免疫化学方法中干扰物可能和抗体发生交叉反应。例如茶碱方法中咖啡因的干扰。干扰物可能催化某一反应，反应结果中和了底物。例如腺苷激酶可在CK反应中消耗底物ADP。4水取代作用非水物质，由于取代了血浆中部分水体积，影响了一些分析物的测定。这些作用考虑或不考虑为干扰作用，取决于要求的结果是以总体积的浓度表示，还是以血浆水的浓度来表示。临床要求较之分析原理更重要，须确定是否考虑取代作用是一个干扰，例如用火焰光度法或间接电位法作NA测定时，高脂血症被考虑为是一种干扰。因为NA在血浆水中的浓度在临床上有重要意义。四临床重要性19/221干扰对于总分析误差有时是一个主要因素，每个病人结果和真值间的偏离可能有三个原因1系统偏差；2不精密度；3干扰。干扰实验评价主要估计偏倚和不精密度的作用，干扰试验通常受标本条件所限，对实验室技术人员而言通常是溶血、黄疸和脂血。2干扰可视作系统的和随机的。对一个特别监测的病人而言，如干扰物总是以同一浓度存在的话，偏倚将是恒定的，偏倚随干扰物浓度而改变。这种干扰是系统的。对于一给定病人人群，由于干扰物浓度各异，由干扰物所形成的偏倚将是随机的，而且显著地作用于总随机误差，影响病人结果。无论何种情况，由一个干扰物引起的未预料作用可导致对实验室结果解释的严重误差。3实验室是克服这些问题的主要角色，可由1只使用对干扰物的敏感度不高和确定的方法。2获取资料，确定是否有干扰物质存在于样品。3告诉医生，由于有干扰存在，结果可能是不可靠的。20/22厂商可提供给实验室完整的有关干扰评价的结果文件，这是很好的资料来源。五实验步骤的综述有两种基本方法评价检测系统或分析方