微生物检验 第三篇 病毒.ppt

临床病毒学检验,第一节病毒的形态结构,体积微小，结构简单，非细胞型微生物只含一种核酸在活细胞内寄生以复制方式进行增殖对抗生素不敏感，干扰素可抑制其增殖；,葡萄球菌(1000nm）,牛痘病毒300250nm,A,B,C,D,E,F,G,立克次体450nm,衣原体390nm,A、大肠杆菌噬菌体(6595nm),B、腺病毒(70nm),D、乙脑病毒(40nm),E、蛋白分子(10nm),F、流感病毒(100nm),G、烟草花叶病毒,C、脊髓灰质炎病毒(30nm),形态,球形杆形子弹状砖块状蝌蚪状,病毒体结构模式图,壳粒,衣壳,核心（核样物）,核衣壳,包膜,包膜病毒,包膜子粒,吸附,穿入,脱壳,生物合成,释放,组装成熟,病毒没有正常的细胞结构，缺乏一些与代谢有关的酶，单独不能复制，必须在活细胞内增殖,第二节病毒的增殖,裸露病毒：胞饮作用,不同病毒，穿入方式不同,包膜病毒：包膜与细胞膜融合,噬菌体：注入式,病毒的配体位点与细胞表面的特异受体结合,三、脱壳,不同病毒脱壳方式不同多数病毒在宿主细胞溶酶体酶作用下脱壳,四、生物合成,宿主细胞内进行的，在病毒基因控制下的病毒核酸和蛋白质的合成过程,先合成一些复制酶、抑制蛋白，抑制宿主细胞的正常代谢，使细胞代谢向着有利于病毒合成的方向进行,再依据病毒基因组的指令，进行病毒核酸的复制、转录和翻译,六、释放,出芽释放溶细胞释放,组装：DNA病毒：一般在核内组装RNA病毒：多数在胞浆内组装,病毒的致病作用,水平传播（Horizontaltransmission）病毒主要通过皮肤、粘膜（呼吸道、消化道、泌尿生殖道）传播，在特定条件下直接进入血液（输血、机械损伤、昆虫叮咬等）而感染机体。所引起的感染，叫水平感染(Horizontalinfection)垂直传播（Verticaltransmission）经胎盘、产道，病毒直接由亲代(母亲)传播给子代(胎儿/新生儿)的传播方式。导致的感染，称为垂直感染(Verticalinfection）,病毒感染的类型,（一）隐性感染（inapparentorsubclinicalinfection）非显性感染、亚临床感染病毒侵入机体内，不引起临床症状的感染形成原因：病毒毒力弱、机体防御较强，病毒不能大量增殖，未造成细胞、组织严重损伤；或最终不能侵入靶细胞。意义：获得免疫力；,（二）显性感染（apparentinfection）,病毒感染后，患者出现明显的临床症状可表现为局部和全身感染；1、急性感染：潜伏期短，发病急，病程短，恢复后病毒被彻底清除，机体获得免疫力。如流感，甲肝等。2、持续性感染（persistentinfection）：病毒在体内持续存在几个月,几年,几十年，甚至终身携带，经常/反复有病毒排除体外，但缺乏持续性的临床表现。,病毒能持续存在于体内的原因,病毒Ag弱，不足以引起机体免疫反应；病毒Ag变异，机体免疫系统不能有效识别；病毒基因整合在宿主细胞染色体上，病毒与细胞共存；病毒直接侵犯免疫细胞，造成免疫功能下降;,1、慢性感染（chronicinfection）显性、隐性感染后，病毒未完全清除，持续存在血液或组织中，处于持续增殖状态，并不断排出体外。临床症状可有、可无。病程长（数月、数年、数十年），病毒慢性进行性损伤机体，并能检出病毒的存在。2、潜伏感染（latentinfection）显、隐性感染后，病毒存在于一定组织或细胞内，不产生感染性病毒体。在某些条件下，病毒基因被激活而急性发作，增殖出病毒颗粒，出现显性感染。,3、慢发病毒感染（slowvirusinfection）,又称迟发病毒感染（delayinfection）;病毒感染后，在机体内经过长期潜伏(数月、数年、数十年)后，出现慢性进行性疾病，最终导致死亡;常见病毒引起：HIVAIDS;麻疹病毒亚急性硬化性全脑炎（SSPE）非常见病毒/待定致病因子引起：朊粒羊痒疫(scrapie)，库鲁病(Kulu)等,病毒的致病机制,（一）病毒对宿主细胞的直接作用1、杀细胞性感染多见于裸露病毒机制：-阻断细胞大分子合成；-破坏细胞溶酶体；-病毒毒性蛋白的作用；,2、细胞膜的改变,细胞融合形成多核巨细胞，细胞功能受损。细胞膜表面出现新抗原病毒增殖，将自身蛋白表达在宿主细胞膜上，改变宿主细胞膜成分,3、细胞转化,某些病毒的DNA和宿主细胞的染色体整合，可使细胞遗传性状发生改变，导致肿瘤的发生4、形成包涵体病毒感染C后，在光镜下可见，胞浆或核内出现嗜酸或嗜碱性的团块结构，称为包涵体。形成机制：V颗粒的聚集；V增殖的场所；C对V的反应产物；,C表面的V-Ag细胞暴露的自身抗原,体液免疫细胞免疫,损伤宿主C,肾毛细血管基底膜蛋白尿,血尿V-Ag+Ab关节滑膜关节炎肺部支气管炎、肺炎,A.,B.,IC,（二）病毒感染的免疫病理损伤,1、体液免疫损伤（II,III型超敏反应）受染细胞表面有V-Ag、IC沉积自身免疫,2、细胞免疫损伤（IV型超敏反应）3、直接损伤淋巴细胞或淋巴器官如：HIV直接损伤CD4+T细胞（三）病毒的免疫逃逸通过编码特异性抑制蛋白或形成合胞体是病毒在细胞间传播。,第二节宿主的抗病毒免疫,一、非特异性免疫：IFN,NK细胞（一）、干扰素(Interferon,IFN)1、定义：病毒或干扰素诱生剂刺激机体的多种细胞(巨噬细胞、淋巴细胞、体细胞等)，产生的抑制病毒增殖的糖蛋白。2、分类:IFN类型主要来源特点I型IFN人WBCIFN人成纤维C抑制病毒作用IIIII型IFNTC抗肿瘤、免疫调节作用III,IFN细胞基因抗病毒蛋白自身和邻近细胞降解病毒mRNA抑制病毒蛋白合成抑制病毒组装、释放抑制病毒复制中断病毒感染；限制病毒扩散,3、作用机理不是直接杀灭病毒,4、生物学活性:,（1）、广谱的抗病毒作用；抑制病毒感染、阻止病毒在体内扩散、促进痊愈;（2）、调节免疫功能；（3）、抑制肿瘤细胞生长；,（二）NK：非特异性杀伤病毒感染的靶细胞,特点：不受MHC限制、不依赖Ab；可通过多种途径活化；杀伤机制：NK接触靶C释放穿孔素、TNF破坏受染C,（一）、体液免疫：中和病毒（二）、细胞免疫：主要靠TC释放穿孔素、颗粒酶，致敏TH1释放的多种淋巴因子发挥作用,二、特异性免疫,第三十三章病毒学检验基本技术,一、标本采集与送检：原则：尽早采取、部位适宜、冷藏速送：冰块或干冰、50%的甘油缓冲盐水、抗生素双份血清标本：急性期、恢复期双份血清,二、快速检查方法,光镜-包涵体,电镜,免疫荧光,ELISA,分子生物学技术,杂交,Southernblot,PCR,Northernblot,三、病毒的分离培养,检验标本杀灭杂菌(青链霉素),接种,病毒分离的一般程序：,动物接种出现病状鸡胚接种病变或死亡细胞培养细胞病变,鉴定病毒种型,第三十四章呼吸道病毒,1.掌握呼吸道病毒的种类和致病特点；流行性感冒病毒、SARS冠状病毒、禽流感病毒、副黏病毒科病毒的生物特性和微生物检验。2.熟悉流行性感冒病毒、SARS冠状病毒、禽流感病毒、副粘病毒科病毒的临床意义。3.了解其他呼吸道病毒的生物特性、临床意义和微生物检验。,教学目的与要求,呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据统计，90%以上的急性呼吸道感染由该类病毒引起。,呼吸道病毒引起的主要疾病,呼吸道病毒,流行性感冒病毒,禽流感病毒,副粘病毒科,其它呼吸道病毒,第一节正粘病毒科一、流行性感冒病毒（influenzavirus）,（一）分类据RNP和M蛋白抗原性分：甲、乙、丙三型甲型根据HA和NA抗原性不同，又分若干亚型（H1H16、N1N9）乙型、丙型至今未发现亚型,（二）临床意义,“流行性感冒”（Influenza）是英国人Johnhuzxam在1743年创造的字，他依据意大利语中用来描述这个疾病起源的片语“uninfuenzadifreddo”，即“寒冷的影响”。它主要发生在深秋、冬天和早春季节。每年都有数以百万计的人群受到感染。,50年代以来共三次,1957年，H2N2，贵州1968年，H3N2，香港1977年，H1N1，辽宁先集体，后散居先城市，后农村,传染源：显、隐性患者、感染的动物传播途径：呼吸道飞沫传播V呼吸道粘膜柱状上皮C病变坏死粘膜充血、水肿炎症鼻塞、咽喉肿痛、咳嗽、卡他等症状毒性代谢产物（局部症状）入血发热、头痛、肌肉酸痛、乏力等（全身症状）V不入血，只在呼吸道上皮局部增殖,（三）生物学特性,1、形态结构：流感病毒呈球形或丝状，球形直径80-120nm，新分离株丝状多于球形,有包膜，单链分片段的RNA病毒。,流感病毒结构,表面：血凝素(HA)柱状，为三聚体，基本上以相同的间距覆盖了病毒的全部表面HA1（吸附）HA2（核衣壳释放）血凝抑制抗体(保护性抗体)神经氨酸酶（NA）四个亚单位组成的四聚体，并不平均分布在病毒表面，而是聚合成群。与病毒释放有关。,内部：1、核衣壳病毒分片段的RNA，结合有核蛋白（NP）以及与复制和转录有关的三种依赖RNA的RNA多聚酶蛋白。呈螺旋对称。2、基质蛋白（M蛋白）覆盖在核衣壳外面，M蛋白抗原性稳定，也具有型特异性。M1(增加包膜厚度)M2(辅助HA2释放核衣壳)3、包膜来自宿主细胞的脂质双层膜。,流感病毒的内部结构,1、核衣壳病毒分片段的RNA，结合有核蛋白（NP）以及与复制和转录有关的三种依赖RNA的RNA多聚酶蛋白。呈螺旋对称。2、基质蛋白（M蛋白）覆盖在核衣壳外面，M蛋白抗原性稳定，也具有型特异性。M1(增加包膜厚度)M2(辅助HA2释放核衣壳)3、包膜来自宿主细胞的脂质双层膜。,NA,HA,包膜,基质蛋白,核衣壳,RNA,核蛋白,RNA聚合酶,2、变异,抗原漂移（antigenicdrift）因HA或NA的点突变造成，变异幅度小，属量变，引起局部中、小型流行。抗原转换（antigenicshift）因HA或NA的大幅度变异造成，属质变，导致新亚型的出现，引起世界性的暴发流行。,3、培养特性鸡胚培养：不引起鸡胚出现病变，取羊水或尿囊液做血凝试验细胞培养：红细胞吸附试验4、抵抗力较弱，不耐热，对干燥、乙醚、甲醛和乳酸等敏感。,微生物检验,病毒分离培养(金标准)取患者咽漱液或鼻咽拭，接种鸡胚或培养细胞抗原检测直接从病人呼吸道分泌物、脱落细胞中检测抗原分型鉴定核酸杂交、PCR、序列分析血清学诊断血凝抑制试验、中和试验、补体结合试验、酶联免疫测定,二、禽流感病毒,（一）临床意义,截止2013年5月11日，全国内地共报告人感染H7N9禽流感确诊病例130例，其中死亡人数33人，康复人数45人。病例分布于北京（1例）、上海（33例，死亡14例）、江苏（27例，死亡8例）、浙江（46例，死亡7例）、安徽（4例，死亡2例）、福建（5例）、江西（5例，死亡1例）、山东（2例）、河南（4例，死亡1例）、湖南（2例）10省市的39个地市。另有台湾1例。尚未发现人传人的证据。,H7N9,（二）生物学特性,类似流行性感冒病毒,（三）微生物检验,标本采集与处理：常规采集全血、死亡动物肠内容物、肛门拭子、气管、肺、肠、脾、肾、脑、肝和心脏标本。分离培养：鸡胚培养法病毒抗原及抗体检测：荧光免疫技术和酶免疫技术核酸检测：PCR和RT-PCR,第二节副黏病毒科,特点：病毒体较大;具另一种刺突(F蛋白);单链RNA,不分节段。种类：麻疹病毒腮腺炎病毒副流感病毒呼吸道合胞病毒间质性肺炎病毒,一、麻疹病毒,入侵（CD46为病毒受体）,呼吸道上皮细胞内增殖,入血（第一次病毒血症）,侵入淋巴组织和单核吞噬细胞系统,增殖后再次入血（第二次病毒血症）,多种组织、器官受累，表现为细胞融合成多核巨细胞，核内形成嗜酸性包涵体等,（一）临床意义,麻疹的临床表现,潜伏期约1012天体温略高、咳嗽、流涕、好打喷嚏及泪眼，症状持续35天体温突然升高（达到4040.5C），口颊粘膜出现柯氏斑，随后出现红色班丘疹，从耳部开始，23天后遍及全身4天后消退，脱屑,M蛋白,螺旋状核衣壳（RNA和N蛋白）),HN/H/G糖蛋白突起,多聚酶,脂质双层包膜,F糖蛋白突起,（二）生物学特性,（三）微生物学检验,血象：白细胞总数减低，淋巴细胞相对增加早期诊断：分泌物沉渣检多核巨细胞和病毒抗原血清学检查：特异性抗体病毒分离,二、腮腺炎病毒,（一）临床意义腮腺炎病毒是流行性腮腺炎的病原体，只有一个血清型，人是其唯一宿主病毒通过飞沫或直接接触传播咳嗽、喷嚏甚至说话都可传播病毒学龄儿童为易感人群出现症状前23天及症状消失后9天仍有传染性,（一）临床意义,潜伏期23周在上皮细胞和局部淋巴结内增殖入血，病毒随血侵入腮腺及其它器官主要症状为腮腺肿大、睾丸炎、卵巢炎及病毒性脑炎可获牢固的免疫力,（三）微生物学检验,分离培养：标本：患者唾液、尿液或脑脊液方法：鸡胚羊膜腔、鸡胚细胞培养血清学诊断：病毒IgM或4倍上升的IgG方法：血凝抑制试验、ELISA和免疫荧光技术,三、副流感病毒,（一）临床意义,病毒通过人与人直接接触或飞沫传播，进入人体于呼吸道上皮细胞中增殖，病毒血症罕见。可引起婴幼儿及儿童严重呼吸道疾病。,（二）生物学性状,病毒呈球形，较大，直径为125-250nm。刺突：HN蛋白：具有HA和NA作用F蛋白：具有使细胞融合及溶解红细胞的作用根据抗原构造不同，副流感病毒分为5型。,（三）微生物学检验,实验室诊断可用细胞培养分离鉴定病毒，或用免疫荧光检查鼻咽脱落细胞中的病毒抗原。,四、呼吸道合胞病毒,引起婴幼儿下呼吸道感染的最常见病毒侵入呼吸道后在上皮细胞内增殖，病毒不入血病理免疫造成细胞损伤支气管坏死物与粘液、纤维蛋白粘连在一起，易导致气道阻塞，可并发严重的细支气管炎和肺炎包膜刺突G与受体结合、吸附F强烈细胞融合作用（故名），形成合胞体及胞浆嗜碱性包涵体,SARS冠状病毒,第三节冠状病毒科,（一）临床意义,2002年11月16日中国广东佛山发现第一起后来称为SARS的病例,2003年2月18日中国疾病预防控制中心宣布，广东严重呼吸道综合征的病原基本可以确定为衣原体,3月15日世界卫生组织将此疾改称严重急性呼吸综合征（SARS）,4月16日世界卫生组织在日内瓦宣布，病毒已经找到，正式命名为SARS病毒。,我国内地24个省区市先后发生非典型肺炎疫情，共波及266个县和市(区)。截止8月16日10时，我国内地累计报告非典型肺炎临床诊断病例5327例，治愈出院4959例，死亡349例,2004年3月发生的SARS疫情中，北京和安徽两地共出现9例SARS确诊病例，在短短的几天内有862人被医学隔离。,非典型肺炎症状及体征,1.症状与体征发热（38）和咳嗽、呼吸加速，气促，或呼吸窘迫综合征，肺部罗音或有肺实变体征之一以上。2.实验室检查早期血WBC计数不升高，或降低。3.肺部影像学检查肺部不同程度的片状、斑片状浸润性