疟原虫检验技术

疟原虫检验技术 -血片制作、染色及疟原虫形态鉴别,黔东南州疾控中心检验科潘雪雪,寄生人体的四种疟原虫,间日疟原虫 P. vivax，P.v恶性疟原虫 PFalciparum,P.f三日疟原虫PMalariae,P.m卵形疟原虫POvale,P.o 我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另二种少见，近年偶见国外输入病例。 其它疟原虫 诺氏疟原虫(Plasmodium nowlesi),内容提纲,血片制作与染色疟原虫计数疟原虫的基本形态特征,血片制作,第一步：载玻片的清洗用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，清水冲洗后凉干，浸于95% 的乙醇中1小时以上用绸布擦干置干燥环境中保存。,第二步：患都信息的核实,采集血样涂片时，首先要核对患者的姓名和年龄并在玻片的右侧编号,第三步：采集血样,采血部位：耳垂或无名指， 取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小,薄血膜血量为厚血膜的一半或1/3。,厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将 推片的边缘紧贴载玻片，轻轻上下移动，使血液沿边缘散开，然后匀速地向前推进，形成薄而平铺的薄血膜,第四步：血片制作,厚血膜,薄血膜,制片过程图示,标签,标准的疟疾厚薄血膜片,标签,厚血膜血量不宜过多或过少薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列,血片的制作,血片制作影响因素,载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-10个白细胞为宜；血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇等舔食血膜；制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果,血片染色,两种染色方法:吉氏染色法 1. 染色原液配制 2. 门诊快染、慢染 3. 成批染色和溶血染色 瑞氏染色法 WHO推荐使用吉氏染色法,吉氏染液(原液)的配置,吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油 (纯) 250ml 甲醇 (纯) 250ml吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于5个小时,血片的染色,染色用水和冲洗用水配制常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水用pH7.0pH7.2的缓冲液。,血片染色,薄血膜的固定厚血膜充分干燥, 用甲醇固定薄血膜， 平放待干（要点：甲醇不能触碰到厚血膜）,操作1 （快染） 量筒内量2ml缓冲液(PBSPH7.0) 或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水缓缓冲洗，晾干（血膜朝内面）镜检。操作2 (慢染) 量筒内量2ml缓冲液或净水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色30min。清水缓缓冲洗，晾干镜检。,血片染色,将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏染色液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，染色30分钟。（如染液稀释液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检。,成批血片染色,厚血膜溶血染色,放置多时未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分钟。然后用清水漂洗干净,晾干。,质量好的染色 显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列 如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏硷性,外观吉氏染色血片,偏 酸,偏 碱,标 准,配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量；染液稀释后使用时间：原液必须临用时稀释，随配随用；染液的稀释浓度；染色时间。,染色质量影响因素,用水过酸，可致感染的RBC上的点彩染不出来；用水过碱，则使薄血膜上的RBC染成灰蓝色，致使R的胞浆难以辨论。,染色稀释用水: PH7.0-7.2清洁水。,染色质量影响因素,固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜；血膜在制备后应尽量能在当天染色，一般夏天不超过48小时，冬天也不能超过72小时,放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。,染色质量影响因素,疟原虫镜检, 疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 疟原虫密度计数方法 人体四种疟原虫的形态特征,当前分子生物学、血清学技术快速发展,但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替 代的确诊疟疾的 “金标准” 显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴别4种人体疟原虫,原虫镜检-金标准,疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点,疟原虫密度计算,计算疟原虫密度的三种方法： 白细胞原虫密度计数法(厚血膜 WHO) 优点：可作为定性和定量分析 半定量计数法 (厚血膜) 优点：方法简便 缺点：只能定性，不宜作为定量分析 红细胞感染密度计算法(薄血膜),白细胞原虫密度计数法,镜检厚血膜，按视野顺序，记录200个白细胞中的疟原虫数，如果原虫密度较低（200个白细胞中小于100个疟原虫），可增加白细胞，计数500个。密度单位:原虫数/l计算公式：疟原虫数 计数的白细胞数 患者每微升血白细胞数 = 疟原虫数/l血。如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个白细胞计数(国际标准) 。,白细胞原虫密度计数法,从血膜的左上角开始，横向。计数1个视野后，每次间隔5个视野,再计数。,厚血膜, 不需要计数的视野, 需要进行白细胞、疟原虫计数的视野如果该视野无原虫，则计数白细胞数 看到第一个原虫开始计数,白细胞原虫密度计数方法,白细胞疟原虫计数法,例如 计数200 WBC中有135个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8 000个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：,135（计数的疟原虫数）200（计数的白细胞）x 8000（每微升血白细胞数） =5400 / l,答：该患者的疟原虫密度为5400 / l。,用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估算出疟原虫密度。此方法将密度分为6级：1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野15个虫，记录“”4.平均每个视野6 10个虫，记录“+”5.平均每个视野11 100个虫，记录“+ ”6.平均每个视野100个虫以上，记录“+ ”。 如：Pv R+T+S5G少 这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。,半定量计数法,如何确定疟原虫血片为阴性, 检查全部厚血膜视野未查见疟原虫 最少检查100个厚血膜视野未查见 疟原虫（临床病人）,人体四种疟原虫的分布,疟原虫镜检,感染人的疟原虫有四种:,恶性疟原虫 P. falciparum间日疟原虫 P. vivax三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale,恶性疟 P.falciparum, 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 我国流行区域为云南省和海南省 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状,不及时治疗可危及生命（脑型疟）,间日疟 P.vivax, 间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区 病程良性, 有复发, 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热 带非洲，特别是西非则很少见,三日疟 P.malariae,遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告卵形疟 （蛋形疟） P.ovale主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告在我国已基本消灭,原虫镜检,血细胞,红细胞血小板白细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）,红细胞,红细胞是双面凹的圆饼状边缘较厚，而中间较薄,血小板,各种血细胞模式图 1.红细胞 2.嗜酸性粒细胞 3.嗜碱性粒细胞 4.中性粒细胞 5.淋巴细胞 6.单核细胞 7.血小板,1,2,3,4,5,6,7,疟原虫的基本形态特征,疟原虫基本构造为细胞质(胞浆)、核和疟色素；原虫：经吉氏或瑞氏染色：核呈红色，胞质呈兰色，疟色素为本色；细胞浆：蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多；核：呈鲜红色，呈圆形或椭圆形。核的结构致密，只有在个别发育阶段较为疏松，例如间日疟原虫雄配子体的核。,核,胞浆,斑点,疟色素：不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。间日疟原虫：呈短棒状，黄褐色；恶性疟原虫：呈细砂状，黑褐色；三日疟原虫：呈砂粒状，深褐色；卵形疟原虫：与间日疟原虫相似。,疟原虫的基本形态特征,疟色素,红细胞不涨大环状体纤细, 常有多重感染，环状体内可有2个核 环状体可贴在红细胞边缘 除环状体，配子体外没有其他发育期配子体呈新月形或腊肠形成熟裂殖体约含16-32个裂殖子，排列不规则可出现茂氏点,恶性疟（P.falciparum） 鉴定要点,21. A member of the UN forces in East Timor. Presented with high temperature.,红细胞明显涨大 薛氏点明显 成熟环状体粗大滋养体胞浆有阿米巴样伪足血片中可见各期的原虫形态成熟裂殖体约含12-24个裂殖子,间日疟（P. vivax ） 鉴定要点,2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago.,红细胞不涨大或略小环状体中等大小，核较大，胞浆粗厚胞浆不活跃呈带状形成熟滋养体呈菊花状,内含6-12个裂殖子雌雄配子体小于正常红细胞，色素呈深褐色常可查见各阶段的疟原虫,三日疟（P.malariae） 诊断要点,卵形疟（P. ovale ） 鉴定要点,红细胞正常或略涨大 常见慧星状 (也称齿轮状)环粗大 薛氏点明显 成熟滋养体类似三日疟原虫但更粗大成熟裂殖体约含6-12个裂殖子,18. Recent trip to Southern India- headaches and vaguely unwell.,混合感染的鉴别,容易鉴别的混合感染1）同一血膜中发现间日疟各期原虫和恶性疟雌雄配子体。2）同一血膜中发现大量纤细的恶性疟环状体，并混有少量间日疟原虫。不易鉴别的混合感染1）间日疟各期原虫和粗环的恶性疟环状体。2）仅有间日疟和恶性疟的环状体。,厚血膜中容易被误认为疟原虫的物质, 未成熟的网织红细胞溶血后的残影易被误为薛氏点 重