蛋白质的修饰和表达ppt课件

精选的PPT，第三章蛋白质的修饰和表达，蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要研究内容和手段。说明蛋白质变形的化学途径、蛋白质变形的分子生物学途径、重组蛋白质的表达等。所选择的PPT，蛋白质修饰化学途径的第一部分，蛋白质的化学修饰：通过活性基团引入或去除，改变蛋白质的初级结构的过程。在某些情况下，化学结构的变化不会影响蛋白质的生物活性，这种修改称为非必需部分的修改。但是在大多数情况下，蛋白质结构的变化会改变生物活性。选择的PPT，影响化学变形的主要因素为1，组间氢键和静电作用等基于蛋白质功能的活性反应，组间空间阻力。2、改性剂反应活性。所选择的PPT，I，蛋白质侧链的化学修饰，在20种天然氨基酸的侧链中，约有一半能在充分温和的条件下生成化学置换，而不会引起肽键的损伤。特别是氨基、巯基、羧基很容易产生有用的替代品。任何给定的氨基酸残余都可能在蛋白质分子中出现一次以上，因此，如果用化学方法修改氨基酸，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都将被替换。尽管侧链PK值和端组pK值之间存在差异，但在化学上很难将肽链的-氨基或-羧基组与侧链的氨基或羧基区别开来。特定PPT，蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂或亲和度标记试剂和蛋白质分子侧链的特定功能组的化学反应实现的。所选择的PPT，(a)由于巯基化学修饰非常强的亲核性，巯基基团通常是蛋白质分子中反应最强的侧链基团。烷基化试剂是重要的巯基改性试剂，尤其是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前碘乙酸常用于羧甲基化巯基组，防止半胱氨酸分解。其他卤代酸，卤代酰胺也可以修改巯基。N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修饰试剂，具有强特异性，伴随光吸收的变化。选定的ppt，5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)是目前最常用的巯基修饰试剂之一，它形成巯基反应和二硫基，在蛋白质分子中形成2-硝基-5-硫代苯甲酸(TNB，所选择的PPT，(b)氨基的化学修饰赖氨酸的-氨基是蛋白质分子中亲核反应性高的组，是蛋白质或多肽分子与受精作用比较容易的部位。常用的改性剂包括三硝基苯磺酸、烷基化试剂、氰酸酯、盐酸吡哆醛等。部分PPT，(c)羧基的化学修饰谷氨酸，天冬氨酸修饰方法非常有限，产物一般是脂质或酰胺。所选PPT，(4)二硫键的化学修饰一般为硫醇乙醇等变性剂，将二硫键还原为自由巯基，通过硫醇甲基化处理防止二硫醇再氧化。所选择的PPT，(5)其他侧链基团修饰1，组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来修饰。某些ppt，2，酪氨酸残留的变化可能是对酚羟基或芳环的取代反应。部分ppt，3，精氨酸残留含有胍残留的强碱性，这使大多数试剂和修饰反应变得困难，但能与二羰基化合物反应。某些ppt，4，色氨酸吲哚取代反应或氧化降解可能发生。N-溴琥珀酰亚胺(NBS)可以氧化吲哚基团成为羟基吲哚衍生物，但特异性下降，酪氨酸残留也可以对该试剂反应。选定的ppt，5，蛋氨酸主要是硫原子的亲核性引起的，部分氧化剂可以氧化蛋氨酸。，具体PPT，第二，蛋白质部位特异性修饰，特异性包含两个意思：一，试剂对受精组的特异性；第二，试剂对蛋白质分子中修改的部位，例如膜蛋白的激素结合部位，酶的活性部位等部位具有特异性，一般来说，这种试剂不仅对作用机理具有特异性，对作用部位也具有专一性。这种特异性的化学修饰，称为亲和标记或特异性的不可逆抑制效应。这种修饰试剂也称为位点特异性抑制剂。特定的PPT，(a)亲和度标记亲和度标记亲和度标记是一种基因修饰，也称为特异性不可逆抑制效果，因为酶在活动部位是独占的，酶是不可逆的。首先，PPT，这些抑制剂可以分为两类。一种是Ks型不可逆抑制剂，根据基质结构设计，具有与基质结构相似的结合组，具有与活性部位氨基酸残基侧链组反应的活性组。精选的PPT，另一类是Kcat类型的不可逆抑制剂，按酶催化过程设计。这种抑制剂的结构与气质相似，具有酶催化结合的性质。另外，在酶催化它的时候，这个潜伏期由酶催化激活，在活性部位有不可逆转的抑制作用的潜伏反应器。这种抑制剂特异性高，被称为“自杀气质”。部分PPT，(b)光亲和度标记等试剂在结构上除了一般亲和度试剂的特性外，还具有光反应器。反应一般分两个阶段进行。第一步，试剂首先在蛋白质的活性部位和暗淡的条件下发生特定的结合。第二阶段，光照，试剂被光激活后，产生非常活跃的官能团，与活性部位侧链组反应。所选的PPT，iii，蛋白质聚乙二醇修饰，聚乙二醇(PEG)由环氧乙烷聚合，两端有羟基，一端用甲基氯封闭，则得到单甲基氧聚乙二醇(mPEG)。最常用于蛋白质修饰的是mPEG衍生物。精选的PPT、peg与蛋白质的非必需组共享结合时，作为阻止蛋白质分子表面的一个屏障，使用抗原决定基，避免产生抗体，或阻止抗原和抗体的结合，从而抑制免疫反应。也可以保护蛋白质不容易被蛋白酶水解。修改后分子量增加，肾小球过滤减少。这些有助于延长蛋白质药物的半衰期。选择PPT，修改，peg首先激活，激活peg与蛋白质分子侧链的各种化学组反应，与蛋白质结合，蛋白质分子中的peg结合组主要是氨基，巯基，羧基。所选择的PPT，4，蛋白质的化学交联，化学交联是分子内的亚碱，或者蛋白质分子和分子之间，或者蛋白质分子和分子之间，可能发生的网状交联的形成。交联剂是包含双官能团的化学试剂。像戊二醛蛋白这样的化学结合是指将蛋白质分子与化学惰性水不溶性载体结合，形成固定化蛋白质。选定的PPT，蛋白质分子的固定化，蛋白质分子的固定化主要是酶分子的固定化。固定酶，使用固体物质在特定部位约束或限制酶，酶仍然具有特有的催化反应，回收和可重复使用的技术之一。优点：1，在保持酶活性的同时，克服玻璃酶的几种不足，提高酶分子的稳定性。2、可与生产工艺分离，可与生产工艺有效控制，3、可与生产产品分离，可省略热处理停用酶的步骤，可简化生产工艺，4、可在生产中重复使用酶，提高酶利用率。特定的PPT，酶固定化可以通过吸附法、交联法、嵌入法、共价法完成。1、交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白或酶分子与载体之间进行交联，使酶分子相互交叉形成网络结构的固定化酶。常用的交联剂是戊二醛和双氮联苯胺-2，2-二磺酸。选择的PPT，交联方法有4种形式：1)酶直接交联方法：在酶溶液中添加适量多功能试剂，形成不溶性衍生物。(2)酶辅助蛋白交联方法：酶有限时酶和惰性蛋白共同交联的方法。3)吸附交联方法：首先将酶吸附到二氧化硅、膨润土、氧化铝、球形酚醛树脂或其他大孔离子交换树脂上，然后用双功能试剂(如戊二醛)交联。(4)载体交联方法：用多功能试剂的部分功能机对聚合物载体进行化学转化，其中的另一部分是功能性基团结合酶蛋白。精选的ppt，2，共价键法是在酶蛋白分子相功能团和固定支架表面的反应群之间形成化学共价键，固定酶的方法。常用载体包括天然高分子(纤维素、琼脂糖、淀粉等)、合成聚合物(尼龙、聚氨基酸)、无机支撑物(多孔玻璃)、选择性PPT、影响因素：1)需亲水性和一定的机械强度和稳定性，在温和条件下与酶结合的官能团24)考虑酶固定化构成，应尽量减少载体的空间阻力对酶活性的影响。所选择的PPT，第二节蛋白质的分子生物学修饰，蛋白质的分子生物学修饰主要有基因突变，基因融合和非天然氨基酸的混合方法。选定的PPT，I，基因突变技术是在基因水平上对编码的蛋白质分子进行转化，研究表达后蛋白质结构功能的方法。根据变形策略，可以分为定点突变和定向进化两种，前者是合理的设计方法，后者是不合理的设计方法。特定PPT，(a)定点突变改变、缺失或插入已知基因的特定碱基。具有突变率高、简单、重复性好的特点。野生型绿色荧光蛋白(wtGFP)由紫外线发出少量绿色荧光，通过其发光域的特定氨基酸定点变形，现在GFP可以在可见光的波长范围内发光，发光强度比原来强100倍以上，甚至出现绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。选定的ppt，1，嵌套扩展PCR技术采用具有互补末端的引物，PCR产品形成嵌套链，在后续放大反应中通过嵌套链的扩展将不同来源的放大片段重叠在一起。为提高精选PPT，精选PPT，葡萄糖异构酶的热稳定性，用2引物对葡萄糖异构酶基因进行体外突变后，用pro 138取代Gly138，突变葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型增加了两倍，反应温度最高提高了10-12度。选定的ppt，2，快速定点突变必须是质粒：通常从E.coli中提取的纯化工具包(Miniprep)或氯化铯纯化中提取的质粒。然后，设计了包含突变部位的引物对(正、反)，模板质粒退火后pfu turbo聚合酶“循环扩张”，(所谓循环扩张是聚合酶用模版扩大引物，一圈后结束到引物5结束，经过重复加热退色延长周期)。)正负引物的扩展产物，退火后使成对丢失的开环质粒。利用DpnI酶的延长产物是原始模板质粒来源于现有的大肠杆菌，被dam甲基化转化，对DpnI敏感，被切断，而体外合成的突变序列的质粒没有甲基化，因此在转化过程中成功转化，得到突变质粒的克隆。，通过模仿所选择的PPT，(2)实验室中自然进化的关键阶段突变、重组和筛选，长期完成自然进化过程，有效地改造蛋白质，使其适合人类需要。这个策略只针对特定蛋白质的特定特性，这称为定向进化。需要两种支持技术，一种是生成为进一步审查提供丰富材料的多个突变；二是有适当的筛选系统，从突变问题银行快速筛选出符合目标的蛋白质。特定ppt，1，制造突变，(1)容易PCR的基本原理是在正常PCR反应系统中改变特定成分的数量或质量，随机引入错误碱基，形成序列多样性的DNA序列库。关键是选择适当的突变频率。诱变结果在一般目标基因内取代1.5-5个碱基时最为理想。一次误操作PCR往往难以取得满意的结果，因此使用了很多连续误操作PCR方法。选定的ppt，dnashufingallowsaceleratevolutilofgenes，选定的PPT，2，筛选，(1)表型观察选择和筛选菌落分泌的蛋白酶，可以在含酪蛋白的琼脂平板上形成明确的水解权。在高温和蓝色蔗糖基质存在的条件下，根据菌落周围物体的颜色变化，筛选高温状态下的xylanase。ppt，(2)高吞吐量筛选方法噬菌体显示技术，细菌显示技术，酵母显示技术，核糖体显示技术，酵母2混合系统等。噬菌体显示技术是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合，并在噬菌体表面展示的技术。某些PPT、phagedisplaymethod (1)、M13(afilarimenouspagecontainingss-dnaencasedinaproteincoat): contain大幅提高了审查通量。提出了通过连接第一个蛋白质基因的终止密码子去除和具有终止密码子的第二个蛋白质或多肽基因，使两个基因的融合表达成为可能的基本原则。精选的PPT，1 .利用基因融合技术表达外源基因的原因(1)，通过形成特定蛋白质或其特定域和融合蛋白，可以有效地回收、纯化表达产物。(2)与功能不同的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白质。(3)与报告分子的融合蛋白结合，应用于蛋白质位置或转基因动物。(4)避免蛋白质水解酶水解(5)改变细胞溶解度，防止包涵体的形成(6)放置在宿主的其他位置。PPT、2。基因融合策略(1)方法a酶切后直接切到适当的信号肽，b在目的基因两端各粘贴不同的亲和标签，蛋白质净化c将目标基因插入信号肽序列和插入序列之间，成为可插入细胞膜和细胞壁的蛋白质符号。选定的ppt，(2)融合蛋白连接被设计并选定为一个大的子设备，其中连接的氨基酸链是链环。因素：长度在10 15个氨基酸之间具有一定的灵活性，不会产生次级结构。选择非疏水氨基酸时，常用的顺序是(GGGS)3。选定的ppt，3，融合蛋白标签目的：为了纯化重组蛋白，对目的蛋白进行监测和定向固定，提高重组蛋白的产量，提高可用性和稳定性等。常见片段：聚精氨酸、聚组氨酸、标志、c-myc等。这种蛋白质不干涉融合蛋白。，选择的ppt，4，融合蛋白报告分子目的：校准目的基因的表达调节应用：启动子分析，转基因及其表达监测，细胞的信号传递，药物的筛选特征：1，报告基因不存在于宿主中，或应容易与内源性基因区分2，