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HPLC测定发酵液中氨基酸的含量一、主要试剂及配置方法衍生试剂溶液：0.5 2,4二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液衍生缓冲溶液的配制：称取衍生缓冲溶液固体组分（NaHCO3）4.2g加入至100mL容量瓶中，定容并摇匀后备用。定容缓冲溶液的配制：称取定容缓冲溶液固体组分（磷酸二氢钾）3.4g，加入至500mL容量瓶中，加入0.1mol/LNaOH145.5mL定容。流动相A的配制：乙腈水（1：1）：相同体积的乙腈与水混合，超声波脱气10-15min。流动相B的配制：流动相B固体成分（NaAc）8.2g加水至2000mL，超声波脱气10-15min。氨基酸标样：每种色谱纯氨基酸标品秤取0.5g，用水溶解后，定容至100mL，配成5g/L的氨基酸标准溶液。发酵液预处理：用可调微量移液器吸取1.0mL发酵液于1.5mL小离心管中，高速离心（10000r/min，2min）沉淀菌体等固形物。二、衍生方法准确量取发酵液原液2微升，加入装有0.2mL衍生缓冲溶液的5mL塑料离心管中，然后加入0.1mL衍生试剂溶液，摇匀，注意不要漏液，将塑料离心管置于60水浴中暗处恒温加热60min后取出，注意不要让水进入离心管，放置待溶液冷至室温后，加入定容缓冲液0.7mL并摇匀，放置15min后可以开始进行色谱分离。三、色谱分离条件色谱柱为依利特公司氨基酸分析专用ODS柱或C18柱；检测系统为：紫外检测器，柱温：33；采用二元梯度分析，梯度程序如表所示；波长360nm检测；流动相总流量为1mL/min。流动相梯度时间表序号流量/mL/min时间/min流动相A/%流动相B/%线性设定备注1101684Line初始状态210.31684Line3143070Line4173466Line51124357Line61225545Line71255545Line8134982Line91011384016168484Line系统开始重新平衡，恢复到初始状态四、计算方法定性和定量方法(1)根据保留时间和紫外吸收谱进行定性分析。(2)外标峰面积法进行定量测定。(3)计算a.标准曲线的绘制 以不同浓度的氨基酸标准液测得的峰面积为纵坐标，氨基酸含量为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程： Y=kX 式中Y：峰面积 X：氨基酸标准品浓度b.发酵液中氨基酸
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