基因工程-6章 重组DNA导入受体细胞PPT课件

2020/5/26,.,1,.,载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：a.未连接的载体分子b.未连接的DNA片段c.载体的自连d.含有错误插入片段的重组DNA分子e.重组DNA分子,.,转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，寄主的酶可降解这些DNA片段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制,.,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,2020/5/26,.,5,第六章重组DNA导入受体细胞,一、受体细胞二、选择受体细胞的基本原则三、重组DNA导入受体细胞的方法,2020/5/26,.,6,一、受体细胞,受体细胞(receptorcell)又称为宿主细胞(hostcell)，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。感受态(competence)是指细菌吸收外源DNA的生理状态。感受态细胞(competencecell)是指具有接受外源DNA能力的细胞。,.,基因工程常用的受体细胞有:,大肠杆菌枯草杆菌土壤农杆菌酵母菌植物细胞动物细胞,.,大肠杆菌,2020/5/26,.,9,1、原核生物细胞的优点,大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。,2020/5/26,.,10,原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也多是无特异性空间结构的多肽链。原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。,.,酵母菌,2020/5/26,.,12,2、酵母菌,酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点酵母菌是结构最为简单的真核生物之一,其基因表达调控机理比较清楚,遗传操作相对较为简单。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属(如酿酒酵母)有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工等。,2020/5/26,.,13,3、动物细胞,常用的动物受体细胞有Hela细胞、猴肾细胞和中国仓鼠巢细胞(CHO)等。,MCF-7,.,哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的RNA。真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰,产物具有较好的蛋白质免疫原性,约为酵母细胞16-20倍。易被重组DNA质粒转染,具有遗传稳定性和可重复性。经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。缺点是:组织培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的转化子CHO细胞，通常需要数月之久,难度较大。,2020/5/26,.,15,二、选择受体细胞的基本原则,便于重组DNA分子的导入。便于重组体的筛选。遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。,2020/5/26,.,16,受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。,2020/5/26,.,17,能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。,稀有密码子：,.,三、基因导入受体细胞方法,转化(transformation)转导(transduction)转染(transfection)微注射技术(microinjection)电转化法(electroporation)基因枪技术(geneblaster)脂质体介导法(liposomemediatedtransfer)其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法等。,2020/5/26,19,.,根据转移基因载体与受体的特性可分为：质粒载体导入受体细胞的方法：CaCl2、电转化法；噬菌体转染细胞的方法：体外包装感染法；DNA导入酵母菌的方法：电穿孔转化法；DNA导入植物细胞的方法：Ti质粒叶盘法、电穿孔转化法、基因枪法；DNA导入昆虫细胞的方法：杆状病毒感染法；DNA导入哺乳动物细胞的方法：磷酸钙共沉淀法、电穿孔转化法、脂质体介导法、基因枪法；,2020/5/26,20,2020/5/26,.,21,转化(transformation):指感受态的大肠杆菌细胞捕获质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒DNA分子的过程。转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞。转染(transfection):指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬菌体或以它为载体构建的重组DNA分子的过程。转导(transduction):指病毒转移真核细胞DNA的过程或噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。,2020/5/26,.,22,1、氯化钙转化法（大肠杆菌）1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收噬菌体DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道,经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。,2020/5/26,.,23,原理是：细菌处于0和低渗氯化钙溶液中，细菌细胞壁和膜通透性增加,菌体膨胀成球形，此时转化混合物中DNA形成抗DNA酶的羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面,经短暂热休克(42)后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内。如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒DNA可得51071109个转化子。,2020/5/26,.,24,.,CaCl2热激法转化感受态细胞,附图1,附图2,2020/5/26,.,26,2、磷酸钙-DNA共沉淀法（动物细胞）,磷酸钙-DNA共沉淀法是指外源基因与磷酸钙混合形成磷酸钙-DNA共沉淀物，可使DNA附在细胞表面，通过细胞吞入摄取或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，这种转染方法称为磷酸钙-DNA共沉淀法。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。,.,磷酸钙-DNA共沉淀法,2020/5/26,.,28,3、共转化（植物细胞）,共转化(cotransformation)基因工程中将两个以上的基因同时导入感受态真核细胞的方法，又称共转染。适用于对不带有可选择标记性状的目的基因进行研究。,2020/5/26,.,29,将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因与目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后可得到复合转导的转化子。共转化常用的报告基因:胸苷激酶基因(tk基因)、抗新霉素基因(neor)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(XGPRT)等。,2020/5/26,.,30,4、电转化,电转化又称电穿孔法(electroporation):是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。最早用于将DNA导入真核细胞,1988年,Dower等人成功应用于大肠杆菌的转化。基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的有效吸收。,2020/5/26,.,31,电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每gDNA可以得到1091010转化子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会有所提高，但同时导致受体细胞存活率的降低，转化效率的提高也因此被抵消。,2020/5/26,.,32,.,电穿孔法,2020/5/26,.,34,2020/5/26,.,35,5、基因枪法,基因枪法(又称粒子轰击法)用高压气体加速把粘有DNA的细微金粉(或钨粉颗粒)打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，完成基因转移的方法。基因枪法适用于动植物组织或细胞、胚胎、细菌及小动物等。基因枪法特点：快速、简便、安全、高效。,2020/5/26,.,36,.,.,.,.,2020/5/26,.,41,6、微注射技术,微注射技术：一般是用微吸管吸取供体DNA溶液，在高倍倒置显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。常用于转基因动物研究。,2020/5/26,.,42,7、脂质体导入法,脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜,从而形成一种囊状物被称为脂质体。脂质体导入法:将DNA或RNA包囊于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞,这种转染方法称为脂质体导入法。,.,2020/5/26,.,44,脂质体介导转染的机制阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用,将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体,其中一小部分DNA能从包涵体内释放,并进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。,.,技术的忧患,1.基因污染：人工组合的基因，可能会通过转基因作物或家养动物扩展到其他栽培作物或自然界野生物种，并成为后者基因的一部分。这就是基因污染。2.基因武器运用遗传工程技术，按人们需要，在一些致病细菌或病毒中，接入能对抗普通疫苗或药物的基因，产生具有显著抗药性的致病菌；或者在一些本来不会致病的微生物体内接入致病基因，而制造出新的生物制剂。,.,发展前景,生物学的研究表明，在地球上有许多动物具有很多种优良的特性，是我们所不具备而又想具备的（猫头鹰可以在黑夜看清东西；壁虎有再生能力）。如果我们具备了地球