α-淀粉酶的生产工艺

-淀粉酶的发酵生产工艺摘要：-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发 酵以及纺织等许多行业。1.菌种的选育 1. 1 细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-3 、 10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。保菌供下次实验用。 12 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。1.3 诱变方法以及变异菌株的筛选诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。以NTG为诱变剂，按一定处理剂量 (g/ml)，在一定pH值的缓冲液中30恒温振荡处理14 h。经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24 h培养形成小菌落。把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30培养36 h。用2#定性滤纸制成5 mm disc(小圆纸片)，并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素(抑菌)。倒入200 mm300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。然后把5 mm disc纸顺序放在培养基表面。用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。把disc培养皿经37，24h分别培养。把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc，用相对应的1 ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。把各种斜面菌株经活化培养，接种于1%淀粉培养基的三角瓶中，进行摇瓶比较实验。将菌株作逐一对比，从中筛选出酶活较高的产酶菌株。经菌种诱变选育-淀粉酶高产菌株为诱变的出发菌株，经NTG反复多次处理，并经淀粉水解圈初筛和摇瓶复筛，来选育-淀粉酶高产菌株。 经NTG反复多次处理，-淀粉酶活力有较大幅度提高。在经5次NTG处理之后，其变异株-淀粉酶活达到34 200 (U/ml)，较出发菌株提高了4.2倍以上，说明该诱变处理及选育方法是行之有效的。经NTG处理所得的变异菌株的产酶稳定性较差,必须经反复多次单菌落分离和摇瓶比较，逐渐筛选出产酶稳定性好的菌株。 2 培养基的优化配制2.1培养基的制作 （1）培养基的类型 培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。（2）孢子培养基 孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。对孢子培养基的要求：营养不要太丰富；所用无机盐的浓度要适量；注意培养基的pH和湿度。 -淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮5、豆饼粉3、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。（3）种子培养基 种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。 -淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.17.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。（4）发酵培养基发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。-淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70、小米糠20、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60，常压蒸汽灭菌1h.本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下： 孢子锥形瓶种子罐发酵罐 （1）孢子制备 将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35静置培养24天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。 (2)种子制备 将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO47H2O 5 mg/L，琼脂2%，pH 6.77.0），37培养3天。然后接入到20L种子罐，37搅拌，通风培养1214小时。此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.36.8,酶活510U/mL），再接种到发酵罐。 (3)发酵罐培养 培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6、豆粕水解液67、Na2HPO412H2O0.8、(NH4)2SO4 0.4、CaCl2 0.2、NH4Cl0.15、豆油1kg、深井水20L，调pH至 6.57.0。 发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%5%种子培养成熟液。培养条件为：温度371，罐压0.5kgcm2，风量120h 为1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培养时间为2836 h。2.2 耐高温-淀粉酶的生产方法耐高温淀粉酶生产工艺，采用地衣芽孢杆菌为菌株，通过一级种子罐发酵、大罐发酵、过滤、成品处理制得。 2.2.1 耐高温-淀粉酶的生产原料有采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）1.5吨种子罐发酵 ，玉米淀粉6%10%，玉米浆1%3%，豆粕2%5%，磷酸二氢钾0.3%0.6%，磷酸氢二钾0.5%2%，柠檬酸钠0.1%0.3%，35吨发酵罐发酵, 玉米淀粉15%30%，玉米粉5%10%，豆粕1%8%，玉米浆2%5%，磷酸二氢钾0.1%0.8%，磷酸氢二钾0.8%2%，柠檬酸钠0.05%0.4%等。 2.2.2 耐高温淀粉酶培养基制作（1） 选取菌种：采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)。（2） 1.5吨种子罐发酵 ，培养基配方：玉米淀粉6%10%，玉米浆1%3%，豆粕2%5%，磷酸二氢钾0.3%0.6%，磷酸氢二钾0.5%2%，柠檬酸钠0.1%0.3%，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，消后pH6.2-6.5；用茄子瓶接入种母，温度371，通风量25-40m/h，pH值6.4，培养时间24-36小时。（3） 35吨发酵罐发酵，培养基配方：玉米淀粉15%30%，玉米粉5%10%，豆粕1%8%，玉米浆2%5%，磷酸二氢钾0.1%0.8%，磷酸氢二钾0.8%2%，柠檬酸钠0.05%0.4%，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，pH6.2-6.4；温度421，风量400-1000m/h，pH值6.4-6.8，培养时间80-100小时；在上述条件下补料分批发酵：以淀粉浓度为150280g/L为发酵初糖浓度，以质量百分比40%70%的淀粉糖溶液作为发酵补料物，在DE值降至1060mg/ml时以阀门开启程度的大小为依据开始持续流加补料，维持发酵液中DE值约为1060mg/ml，控制总糖浓度达到220320g/L时停止补料。（4） 提取浓缩工艺：经絮凝、压滤，二次过滤后，采用超滤膜浓缩，保持料液浓缩过程中温度2045；最后采用精滤板框过滤机，配合硅藻土预涂工艺进行过滤除菌，最终生产出成品。 2.2.3耐高温-淀粉酶的另一种生产方法向成熟的发酵液中加入占发酵液重量1-3的钙离子保护剂或2-5淀粉中的至少一种，在70-90的条件下，进行热处理。将制得的纯化的耐高温。淀粉酶送至压力喷雾塔进行喷雾干燥，制得酶粉，将酶粉调配后，分装即得成品。该耐高温。淀粉酶呈固体状态，酶活力达2万单位g以上，具有较高的稳定性，易贮存和运输。2.2.4用菌种枯草芽孢杆菌T2来提取耐高温淀粉酶枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶制剂的主要生产菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。本实验利用高产淀粉酶的枯草芽孢杆菌T2生产淀粉酶。（一）用此菌种来提取淀粉酶的生产原料枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T2，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。（二）此培养基的制备1.培养基的制备与灭菌发酵培养基：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。分装于100mL锥形瓶中，每瓶50mL，121灭菌20min。2.接种与产酶培养接种环灼烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体，接入液体培养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。37振荡培养48 h。3.离心将发酵液置高速冷冻离心机中10000r/min离心10 min，除菌体，上清液即为淀粉酶粗酶液。2.3 a一淀粉酶发酵培养基优化 231不同碳源对发酵产酶的影响单独选择面粉、大米粉、糊精、淀粉、荞麦、高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖作为碳源，替代基础发酵培养基中的玉米粉，其余培养基成分和发酵条件不变。测定酶活结果，由图1可见，面粉、大米粉、淀粉、荞麦作为碳源时，都有利于米曲霉产酶，而高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖对产酶的促进作用较低。其中面粉对产酶的促进作用最大，因此选择面粉作为最佳唯一碳源。232不同有机氮源对发酵产酶的影响在以面粉为唯一的碳源的条件下，选择玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素、牛肉膏代替黄豆饼粉作为有机氮源，其余条件不变。测定酶活结果由图2可看出，牛肉膏作为有机氮源有利于米曲霉产酶，而玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素作为有机氮源时，对产酶的促进作用较低。从工业生产的角度，牛肉膏的成本太高，产酶促进作用只较黄豆饼粉作为有机氮源的高一些，因此选择黄豆饼粉作为有机氮源。 2.4-淀粉酶的分离制备-淀粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法 2.4.1 -淀粉酶的分离和纯化：高纯度淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化淀粉酶的方法很多，一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。 盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等，是蛋白质分离纯化的主要方法。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性一淀粉酶进行纯化，得到电泳纯级的超耐热耐酸一淀粉酶，纯化倍数为11.7，活力回收率为29.8%。但上述方法存在的共同问题是，连续操作和规模放大都比较困难。 反胶团萃取具有选择性高、正萃与反萃可同时进行、分离与浓缩同步进行、操作简单和易于放大等优点，并能有效防止生物分子变性失活。以CTAB /正丁醇/异辛烷构成反胶团系统，通过反胶团萃取方式纯化精制-淀粉酶。最佳反应条件为: 萃取温度40 ， 水相组成为NaCl 0.03 mol/L，pH 12.0，有机相：无机相= 1：2， 振荡时间10min； 反萃取最佳条件为:温度60， 水相组成为KCl 3 mol/L，pH 4.0,有机相：无机相= 2：1， 反萃取振荡时间10 min。在上述条件下，经过一个萃取与反萃取循环后，淀粉酶的萃取率最高可达90. 78%。双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统PEG磷酸盐分离纯化淀粉酶，增加PEG浓度有助于酶富集上相。同样用PEG磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温一淀粉酶，分配系数及回收率分别为4.8和87。采用PEG(聚乙二醇)硫酸铵双水相体系，进行分离纯化淀粉酶，结果表明，在室温下由PEG和硫酸铵所组成的双水相体系，对淀粉酶的回收率可达94.84，分配系数可达17.10。双水相技术有着溶液粘度高、分相时间长，易造成界面乳化等缺点，给实际操作带来很多问题。为了获得高纯度的一淀粉酶，开始人们利用软基质的离子交换色谱和亲和色谱分离纯化了-淀粉酶的粗酶提取液。但是，软基质色谱介质的机械强度小，受压易变形，分析速度慢，分离效率低，柱寿命短，固定相对PH、离子强度和压力非常敏感，反复使用时配体碎片容易脱落。由于以上缺点，软基质色谱有逐渐被硬基质色谱取代的趋势。在硬基质色谱应用方面，李华儒等首次合成一种对一淀粉酶具有特异亲和能力的色谱介质，并成功地分离纯化了工业粗酶，获得了高纯度产品，其活性回收率88%，Kato等也用高效