荧光定量PCR检测项目ppt课件

荧光定量PCR检测项目，HBV-DNA定量乙型肝炎基因型乙型肝炎拉米夫定耐药HCV-RNA定量病毒性脑炎。实时荧光定量PCR方法-ta qman方法，方法：ta qman方法ta qman-水解混合探针，5端标记为荧光报告组(Reporter，R)，FAM，VIC等3端标记为荧光猝灭组(，5 ，3 ，5 ，forward primer，reverse primer，Taqman探测，r，q，TaqMan、displacement、5、3、5、3 、5、forward primer、reverseprimer、r、q、hyrolis、5、3、5、3、5、5、q、r、polymetioncompleted，5 ，3，5 ，5，3，5 ， 5 ， 5 ， r，q，实时荧光定量PCR定义，将荧光组添加到PCR反应系统，使用荧光信号累积实时监视整个PCR过程，最后通过标准曲线定量分析未知模板。实时荧光定量PCR原理实时原理，现有PCR技术：对PCR放大反应终点产品的定量和定性分析不能准确量化起始模板，不能对放大反应进行实时检测，实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化，实时检测PCR放大反应中各周期放大产物的变化，通过Ct值和标准曲线的分析，定量分析起始模板。实时荧光定量PCR原理定量原理，如何量化起始模板？开始模板通过Ct值和标准曲线定量分析，放大曲线、荧光阈值、Ct值、放大曲线，荧光阈值，荧光信号阈值(threshold):前15个循环信号是荧光背景信号(baseline)，即样本的荧光背景值和语音对照组的荧光字段值的默认设置是3 15个周期中荧光信号标准偏差的10倍的手动设置。样本的荧光背景值和语音控制组的荧光峰值值大于，尽力进入指数化的初始阶段，回归系数大于0.99的实际信号：荧光信号达到场值，Ct值，Ct值的定义：PCR放大过程中放大产物的荧光信号达到设定的阈值时经过的放大循环数，Ct值的再现性，Ct值的特征：在同一模板中放大96个，在终点生成的数量不统一；Ct值表示再现性、定量原理，理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1 Ex)nn:放大反应的周期数X:第n个循环后的产物数X0:初始模板量Ex:放大效率，定量原理，放大产物达到临界线时： xct=x0(1 ex)CT=m(1)xct :荧光放大信号达到临界强度时放大产物的数量。设定临界值线后，它为常数，在： log0=logx0 (1 ex) Ct (2)清理方程式(2)中，3360 logx 0=-log(1 ex)* Ct logs(3)log荧光达到域值的周期数越少，即Ct值越小，对数浓度与周期数具有线性关系，根据样本Ct值计算样本中包含的模板量，确定未知样本的C(t)值，从而确定未知样本的C(t)值的初始量、绝对定量、样本采集和配送，血液样本：2ml真空采样管或1.5ml高压灭菌离心力(检查表与标本一起)后，将血清或血浆用一次性吸管吸入消毒的1.5毫升离心管。脑脊液：临床医生采集并放入消毒后的试管，及时接受检查。用于收集临床标本的容器，如试管和离心管，应在使用全高压灭菌及密封标本收集后尽快送到实验室，运输时间超过2小时后，将冰箱送到实验室。如果RNA测量中包含用于添加4mol/L GITC(异硫氰酸酯)的血清(纸浆)标本和用于测量DNA的EDTA抗凝剂等适当稳定剂，则可以在室温下携带或邮寄。注：使用EDTA抗凝全血标本的RNA，在抗凝剂后6小时内分离血浆，使用血清标本的话，尽快(2小时内)分离血清。严禁使用肝素抗凝剂。定量检查的临床意义，治疗前病毒定量检查，指导抗病毒药物选择，避免使用盲目的药物。治疗后定量PCR直接准确测量体内病毒的数量，有助于判断疗效。通过产前定量PCR分析，可以有利地选择怀孕时机。HBV基因型，HBV基因型根据HBV病毒核酸异种8%，8种亚洲主要与b型和c型HBV感染后的临床经过有关。HBV基因型的临床意义，HBV标记去除与b基因型相比，c基因型的HBeAg阳性率更高，每个HBeAg阳性率为16%和53% b基因型的自发HBeAg去除比c基因型早10年，HBeAg去除后进行了肝脏生化，在病毒病原HBsAg阳性者中，c基因型为b基因型的肝功能异常。c基因型引起的临床特征和组织学损害更为严重。乙型肝炎的经过及结果亚洲无症状HBV携带中c基因型与肝硬化及50岁以上肝细胞癌患者的比例较高，而b基因型与50岁以下，尤其是35岁以下肝细胞癌患者有关。药物敏感度在进行干扰素治疗时，b基因型的完全反应率是c基因型的3倍的HBeAg阳性乙型肝炎患者使用拉米夫定治疗时，b基因型患者的HBeAg/HBeAb音韵率是c基因型的2倍，比较了HBV的其他基因型。B型C型流行性低HBeAg阳性率低HBVDNA负荷低致病性中医HCC发病率低(低年龄段高)高(高年龄段高)干扰素治疗整体应答率高抗病毒治疗效果不好肝癌手术预后不好肿瘤血栓栓塞治疗效果不好，请注意，病毒定量103，基因型检测更有意义，HBV-拉米夫定、拉米夫定是高效的“新型乙型肝炎病毒药物”，可以迅速降低HBV-DNA的效价，改善肝组织的弊病，防止纤维化的进行。长期服用“耐药性”会产生HBV基因突变，大大降低HBV对药物的敏感度，从而激活血清中HBV的克隆，增加效价。耐药性机制，HBV聚合酶中y(酪氨酸)m(蛋氨酸)d(天冬氨酸)d(天冬氨酸)变异株的生物学特性：对拉米夫定抗病毒效果的敏感性减少到1/300，DNA减少到1/7。临床症状：血清ALT水平暂时上升，HBV-DNA浓度升高，轻微无助或恶心等肝脏炎症损伤加剧的症状等。I(异亮氨酸)v(巴林)，拉米夫定耐药性，发生率：慢性乙型肝炎治疗6个月后耐药性，亚洲慢性乙型肝炎患者拉米夫定1年，对拉米夫定敏感度的病毒变异发生率降低14%或39%。定义：持续治疗中血清HBVDNA再现耐受性的差异：检测基于敏感度的病毒水平是否是多次/多次抗病毒治疗。拉米夫定耐药的临床意义，耐药性后的临床情况：在耐药性变异发生后1-4个月内病毒再现的情况下，状态也会有很大的变化。无症状变异病毒携带部分患者可能是病毒再生，血清氨基转移酶维持正常。所以即使继续服药，抑制HBV野生菌株，携带变异菌株，生活力低，不会发病。野毒转化部分患者可能在拉米夫定停用3-4个月后，被变异毒复制活性低、复制活性高