硝酸还原酶活力测定

,实验六硝酸还原酶活性的测定,为什么要测定硝酸还原酶活性？!,55,21,24,植物生理生化实验,一、测定意义,硝酸还原酶（NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。,植物的氮源空气中含有近80%的氮气(N2),但植物却无法直接利用这些分子态氮。只有某些微生物(包括与高等植物共生的固氮微生物)才能直接同化利用分子态氮，而植物所利用的氮源,主要来自土壤.。,植物主要利用土壤中的含氮化合物：1、土壤中的有机含氮化合物主要来源于动物、植物和微生物躯体的腐烂分解的产物。但这些含氮化合物大多是不溶性的,通常不能直接为植物所利用，植物只能吸收其中的氨基酸、酰胺、尿素、水溶性的有机氮化物。,2、无机氮化物(以铵盐和硝酸盐为主),铵态氮(NH+4),植物可直接吸收、利用并合成氨基酸,硝态氮(NO-3),必须经过还原形成铵态氮后才能被利用。,硝酸盐的还原在一般的土壤条件下，NO-3是植物吸收的主要形式。NO-3进入细胞后被硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NiR)还原成铵。其中NR是这一反应的限速酶。,NR,NiR,硝酸还原酶催化硝酸盐还原为亚硝酸：NO-3+NAD(P)H+H+NO-2+NAD(P)+H2O,NR,亚硝酸还原酶催化亚硝酸盐还原为铵：,硝酸还原酶是一种诱导酶，诱导物是NO3-，光照可促进硝酸盐的还原过程。诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，但在特定外来物质的诱导下可以生成的酶。如硝酸还原酶可为NO3-所诱导。例如，水稻幼苗本无硝酸还原酶，但如果培养在硝酸盐溶液中，水稻体内就会诱导生成硝酸还原酶，这是高等植物中底物诱导的实例。,离体法：需将材料磨成匀浆，经过低温离心除去残渣，吸取上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。,硝酸还原酶活性测定方法：,活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO-2进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO-2并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO-2的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。,六、操作步骤七、结果计算八、思考题九、注意事项,一、意义及目的要求二、原理三、仪器设备四、试剂配制五、实验材料,实验六硝酸还原酶活性的测定(活体法),55,21,24,植物生理生化实验,1、了解NR测定对植物氮代谢的重要意义及实际应用。2、了解离体法和活体法测定NR的不同点。3、掌握活体法测定NR的原理及其技术要点。4、掌握测定过程相关仪器的使用方法。,二.目的要求,三、原理：,硝酸还原酶可以将NO3-还原成NO2-，其反应为：NO3-+NADH+H+NO2-+NAD+H2O在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO2-含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酰胺发生重氮反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙二胺盐酸盐（或-萘胺）生成红色偶氮化合物，可在540nm下比色测定。反应如下：,NR,四、仪器设备,1、0.2mol/L硝酸钾2、0.1mol/L的磷酸缓冲液，pH=7.5A液：0.2mol/LNaH2PO4B液：0.2mol/LNa2HPO43、1%磺胺4、0.02%萘基乙烯胺5、亚硝酸钠标准液6、30%三氯乙酸,五、试剂配制,六、实验材料:甘薯叶片,1、取样及反应：将甘薯叶片洗干净吸干，用打孔器取大小一致的小圆片，混合均匀，迅速称取0.5克样品3份，分别置于3个50毫升三角瓶中。,七操作步骤及注意事项：,55,21,24,2、NO-2的测定：,55,21,24,根据测定的OD值，从标准曲线查出NO-2浓度（OD值/0.307=g）代入以下公式：NR活性(gNO-2/g鲜叶/h),八.结果计算：,查标准曲线得NO-2浓度（g）10ml,0.5g0.5小时1ml,九、注意事项,1.取样前叶子需进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，否则酶活性低。2.叶片要用打孔器取样(或用剪刀剪成大小一致的小块)。3.无机磷对NR活力有促进作用，因此常用磷酸缓冲液。4.活体法酶促反应在暗条件下进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。5.亚硝酸的磺胺比色法比较灵敏，显色速度受温度和酸度等因素的影响。因此标准液与样品的测定应在相同条件下进行，方可比较。6.叶片要抽气，使叶圆片中