变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)

变性梯度凝胶电泳从实验到分析,2011年9月17日,变性梯度凝胶电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE)最初是Fisher和Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。,1.Introduction,变性梯度凝胶电泳（DGGE）:一种分离相似大小DNA片段的电泳方法。即双链DNA在变性剂(如尿素和甲酰胺)浓度或温度梯度增高的凝胶中电泳，随变性剂浓度升高，由于Tm值不同，DNA的某些区域解链，降低其电泳泳动性，导致迁移率下降，从而达到分离不同片段的目的。由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16sRNA基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异，其中不同土壤微生物的16sRNA基因的V3区扩增的DNA片断在DGGE中的应用最为广泛，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出样品中微生物的种类多少，粗略分析土壤样品中微生物的多样性。,变性梯度凝胶电泳(DGGE),Themethodsofdetectingsinglebasemutations1.Southernblotting2.Single-StrandConformationalPolymorphism(SSCP,单链构象多态性分析)3.DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE,变性凝胶梯度电泳)4.Carbodiimide(CDI，碳化二亚胺检测法)5.ChemicalCleavageofMismatch(CCM，化学切割错配法)6.Rnasecleavage（RNA酶裂解法）7.Heteroduplexanalysis（异源双链分析）8.theProteinTruncationTest(PTT，蛋白截短测试)9.TemporalTemperatureGradientGelElectrophoresis(TTGE,时间温度梯度电泳).,thepaperswhichtitlescontainDGGEin2001-2010,ThearticleaboutDGGE,thepaperswhichthemescontainDGGEin2001-2010,2008-2010,MicrobiologicalcharacterisationofRobioladiRoccaveranocheeseusingPCR-DGGE.Bonetta,S.Carraro,E.Rantsiou,K.Cocolin,L.2008FoodMicrobiology.(IF2.847)2.Variationintheactivediazotrophiccommunityinricepaddy-nifHPCR-DGGEanalysisofrhizosphereandbulksoil.Wartiainen,I.;Eriksson,T.;Zheng,W.W.;Rasmussen,U.2008AppliedSoilEcology.(IF2.247)3.Analysisofcommunitystructureofamicrobialconsortiumcapableofdegradingbenzo(a)pyrenebyDGGE.Luo,Y.R.;Tian,Y.;Huang,X.;Yan,C.L.;Hong,H.S.;Lin,G.H.;Zheng,T.L.2009MarinePollutionBulletin(IF2.63),BulksoilandrhizospherebacterialcommunityPCR-DGGEprofilesandbeta-galactosidaseactivityasindicatorsofbiologicalqualityinsoilscontaminatedbyheavymetalsandcultivatedwithSilenevulgaris(Moench)Garcke.Martinez-Inigo,M.J.;PerezSanz,A.;Ortiz,I.;Alonso,J.;Alarcon,R.;Garcia,P.;Lobo,M.C.Chemosphere(IF3.253)20095.Applicationofreal-timePCR,DGGEfingerprinting,andculture-basedmethodtoevaluatetheeffectivenessofintrinsicbioremediationonthecontrolofpetroleum-hydrocarbonplume.Kao,C.M.;Chen,C.S.;Tsa,F.Y.;Yang,K.H.;Chien,C.C.;Liang,S.H.;Yang,C.A.;Chen,S.C.2010JournalofHazardousMaterials(IF4.144),6.Comparativeanalysesofampliconmigrationbehaviorindifferingdenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)systems.Thornhill,D.J.;Kemp,D.W.;Sampayo,E.M.;Schmidt,G.W.2010CoralReefs(IF3.056)7.Characterizationandbiotechnologicalpotentialofpetroleum-degradingbacteriaisolatedfromoil-contaminatedsoils.Zhang,Z.Z.;Gai,L.X.;Hou,Z.W.;Yang,C.Y.;Ma,C.Q.;Wang,Z.G.;Sun,B.P.;He,X.F.;Tang,H.Z.;Xu,P.BioresourceTechnology(IF4.253),Inadenaturinggradientacrylamidegel,double-strandedDNAissubjectedtoanincreasingdenaturantenvironmentandwillmeltindiscretesegmentscalledmeltingdomains.Themeltingtemperature(Tm)ofthesedomainsissequence-specific.WhentheTmofthelowestmeltingdomainisreached,theDNAwillbecomepartiallymelted,creatingbranchedmolecules.PartialmeltingoftheDNAreducesitsmobilityinapolyacrylamidegel.,2.TheprincipleofDGGE,InDGGE,thedenaturingenvironmentiscreatedbyacombinationofuniformtemperature,typicallybetween50and65andalineardenaturantgradientformedwithureaandformamide.Asolutionof100%chemicaldenaturantconsistsof7Mureaand40%formamide.,SincetheTmofaparticularmeltingdomainissequence-specific,thepresenceofamutationwillalterthemeltingprofileofthatDNAwhencomparedtowild-type.DNAcontainingmutationswillencountermobilityshiftsatdifferentpositionsinthegelthanthewild-type.Ifthefragmentcompletelydenatures,thenmigrationagainbecomesafunctionofsize(Fig1),Fig.1.AnexampleofDNAmeltingpropertiesinaperpendiculardenaturinggradientgel.Atalowconcentrationofdenaturant,theDNAfragmentremainsdouble-stranded,butastheconcentrationofdenaturantincreases,theDNAfragmentbeginstomelt.Then,atveryhighconcentrationsofdenaturant,theDNAfragmentcancompletelymelt,creatingtwosinglestrands.,Thedenaturinggradientmaybeformedperpendicularorparalleltothedirectionofelectrophoresis.（1）Aperpendiculargradientgel,inwhichthegradientisperpendiculartotheelectricfield,typicallyusesabroaddenaturinggradientrange,suchas0100%or2070%.（2）InparallelDGGE,thedenaturinggradientisparalleltotheelectricfield,andtherangeofdenaturantisnarrowedtoallowbetterseparationoffragments.ExamplesofperpendicularandparalleldenaturinggradientgelswithhomoduplexandheteroduplexfragmentsareshowninFigure2,Fig.2.A.PerpendiculardenaturinggradientgelB.Paralleldenaturinggradientgel,ThemeltingbehaviourofDNAfragments,aswellastheoptimalgradientcanbedeterminedexperimentallywithperpendiculargradientgels.Perpendiculargelshaveanincreasinggradientofdenaturantsortemperaturefromlefttoright,perpendiculartothedirectionofelectrophoresis.Thesampleisappliedacrosstheentirewidthofthegelandelectrophoresedforabout4hoursatcertainVolts.,ByusingDGGEorTGGE,50%ofthesequencevariantscanbedetectedinDNAfragmentsupto500bp.Thispercentagecanbeincreasedtonearly100%bytheattachmentofaGCrichsequencetoonesideoftheDNAfragment,Asequenceofguanines(G)andcytosines(C)isaddedtothe5endofoneofthePCRprimers,co-amplifiedandthusintroducedintotheamplifiedDNAfragments.TheGCrichsequenceactsasahighmeltingdomainpreventingthetwoDNAstrandsfromcompletedissociationintosinglestrands.ThelengthoftheGCclampcanvarybetween30and50nucleotides.,GCclamp,Fig.3.Anexampleofwild-typeandmutantDNAfragmentsthatweredenaturedandre-annealedtogeneratefourfragments:twoheteroduplexesandtwohomoduplexesrunonaparalleldenaturinggradientgel.Themeltingbehavioroftheheteroduplexesisalteredsothattheymeltatalowerdenaturantconcentrationthanthehomoduplexesandcanbevisualizedonadenaturinggradientgel.,DNAbandsinDGGEandTGGEprofilescanbevisualisedusingethidiumbromide(EB)orSYBRGREEN.Amoresensitivedetectionmethodissilverstaining,however,silverstainingalsostainssinglestrandedDNA,andsilverstainedgelscannotbeusedforsubsequenthybridizationanalysis,环境样品基因组DNA的提取,目标片段的PCR扩增,DGGE图谱的分析,图像的采集和条带的回收,DGGE分析,电泳前准备工作,电泳分析,剥胶、染色,DGGE条带测序,3.DGGE分析微生物群落的主要步骤,Flowdiagramofthedifferentstepsinthestudyofthestructureandfunctionofmicrobialcommunities.Geneticnger-printingbyDGGEorTGGEofmolecularmarkersistheheartofastrategytostudythepresence(DNA)andactivity(rRNAormRNA)ofbacterialpopulationsincomplexmixtures.Additionalinformationaboutparticularbacterialpopulationswithinthecommunitycanbeobtainedbyhybridisationanalysiswithtaxon-specicprobes.Furthermore,individualbandscanbeexcisedfromthegelsandsequencedtoidentifythecommunitymembers.Thesetechniquesarealsousedtomonitorthesuccessofisolationofbacteriainpurecultures,andtoscreenclonelibrariesforredundancy.,总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合的DNA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要。适合DNA提取方法的考量：DNA的得率。能否进行PCR扩增以及扩增的重复性。制备DNA花费时间的长短。关于DNA提取的建议：优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用酶解/酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购买Qiagen公司相关产品）。,环境样品基因组DNA的提取,选择适合的目标片段，设计合适的引物，注意有GC夹子情况下引物二聚体的行程。环境样品目标片段的扩增最好采用TouchdownPCR。注意PCR的环境，V3区产物扩增极易污染。,目标片段的PCR扩增,细节决定成败！,DGGE分析,从这一步开始，带上手套。配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变性溶液备用，注意变性溶液中大颗粒的过滤及脱气。制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物品摆放的位置。制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。,DGGE前的准备工作,DGGE制胶主体部件：,上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。上样时上样器要深入胶孔底部。尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有markerlane。将胶放入电泳槽中时注意正负极。建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。,电泳,停止电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源剥胶需要细致，用好去离子水和保鲜膜。染色前做好胶样品顺序的标记。银染、EB染色和SYBRGreen染色。,剥胶与染色,垂直电泳,凝胶变性梯度的确定,关于PCR产物的纯化和定量,关于DGGEmarker的制作,获得高质量的DGGE图谱。DGGE条带的回收注意紫外条件下操作的安全。尽量减少DNA在紫外下的照射时间。不同长度目标片段从切胶条带中的回收。测序注意要点回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送去测序每个条带至少测3个克隆,图像的采集和条带的回收,DGGE图谱的聚类分析、相似性分析,DGGE图谱的分析,DGGE图谱的主成分分析,DGGE图谱的数字化Quantityone,DGGE图谱的数字化后的主成分分析,用QuantityOne（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱进行数字化处理。按照如下公式计算多样性指数（Shannon-Wienerindex）其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰度（heightofthepeak）占该泳道总灰度的比例。菌群均匀度（evenness，E）：E=H/Hmax，Hmax=lnS,多样性指数的计算,4.DGGE的优缺点,优点(1)DGGE的最大优点就是无需进行微生物培养，且能检测出难以或不能培养的微生物，同时检测多种微生物（2）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上几乎可以检出所有突变（3）可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析（4）无须标记。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（5)操作简便、快速、重复性好、结果准确可靠。电泳前只需一步操作，DGGE一般在24小时内即可获得结果。PCR-DGGE方法则能客观完整地鉴定微生物，根据参考菌株和样品16SrRNA的PCR产物在凝胶中的相对位置来进行判断若割胶测序，然后序列比对，就可以得出遗传相关性（6)可用于未经扩增的基因组DNA,可检测出象甲基化这样的DNA修饰,缺点,(1)只能分离较小的片段(500bp),对于大片段的分离效率下降(2)DGGE图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株,或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成(3)DGGE通常显示群落中优势种类的rDNA片段,只有占整个群落细菌数量约l%或以上的类群能够通过DGGE检测到。(4)由于某些种类的16SrDNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。(5)DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。(6)需要专门设备，用计算机对序列进行分析，(7)需要进行预实验昂贵的“GC夹板”用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶(8)无法确定突变在DNA片段中位置,附：DGGE操作步骤1.将海绵垫固定在制胶架上，把类似三明治结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。2.共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。3.在两个注射器上分别标记高浓度与低浓度，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置!4.反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cmgels(1mmthick)：设体积调整装置到14