仪器分析技术一2011

第四章常用仪器分析技术（一）,授课人：陈丽琴,现代仪器分析技术种类：光谱分析法质谱分析法色谱分析法,现代仪器分析技术重要性：法医毒物分析这门学科是以现代仪器分析技术为基础发展和建立起来的。鉴定毒物的确证实验和定量试验往往是仪器分析方法，而其它方法往往是毒物鉴定的预试验或筛选试验。例：检测嫌疑人尿样中的毒品吗啡。,免疫分析法,化学显色法,第一节光谱分析法,光谱分析法概论紫外-可见分光光度法荧光分光光度法原子吸收分光光度法,光谱分析法概论,一、光的基本性质二、光谱分析法的概念三、光谱分析法的基本原理四、光谱分析法的分类,一、光的基本性质光是一种电磁波、电磁辐射，具有波粒二象性。光是由光子流组成，光子具有能量：E=hc/=h（E：能量；h：Planck常数；c：光速；：波长nm；频率=c/；波数=1/,cm-1)光的波长越短，能量越大。,单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成)紫外光区：远紫外区10-200nm（真空紫外区）近紫外区200-400nm可见光区：400-800nm红外光区：800nm-1000m（中红外区2.5-25m）,二、光谱分析法的概念在光（电磁波、电磁辐射）的作用下，通过测量物质产生的吸收光或发射光的波长和强度来测定物质的性质、结构或含量的一类仪器分析方法。,任何光谱分析法包括三个主要过程（1）电磁波提供能量（2）能量与被测物质粒子相互作用使其发生能级跃迁光（电磁波）照射物质，物质粒子（分子、离子、原子）能够选择性吸收光子，从能量较低的能级（基态）跃迁到能量较高的能级（激发态），即物质粒子发生能级跃迁，激发态不稳定，瞬间发射光子释放能量回到稳定的基态。光子的吸收和发射伴随着能级跃迁。,三、光谱分析法的基本原理,（3）产生被检测讯号入射与透射电磁波二者强度的变化（反映光吸收程度）发射光子的波长和强度,若某波长电磁波的光子i的能量hc/iEE2-E1,M+hc/iM*,基态激发态E1E2,M+热,M+荧光或磷光,则光子i被选择性吸收：,2.物质对光的选择性吸收,若某波长电磁波的光子i的能量hc/iE,M+hc/iM*,基态激发态E1E2,M+热,M+荧光或磷光,则光子i不被吸收：,物质粒子,能级跃迁类型,发射光的波长和强度,能级分布特征,吸收光的波长和强度,3.光谱分析法进行定性、定量分析的基本原理,分子结构具有特征性能级分布具有特征性吸收特定波长的光完成特征性的能级跃迁形成特征性的吸收光谱（吸收曲线）,用不同波长的单色光照射，测吸光度吸收光谱,4.物质粒子能级跃迁的类型及对应光谱类型,引子：,光谱：光谱是一种图谱，以光的波长或波数为横坐标，以物质粒子对光的吸收或发射强度为纵坐标。分为吸收光谱和发射光谱两类。光谱本质上是反映了物质粒子能级跃迁的特征。,物质粒子能级跃迁的类型及对应光谱类型：,四、光谱分析法的分类（1）吸收光谱法（紫外可见分光光度法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法）发射光谱法（荧光分光光度法）（2）分子光谱法（紫外可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法）原子光谱法（原子吸收分光光度法）,紫外-可见分光光度法,一、朗伯比尔定律二、紫外-可见吸收光谱三、紫外-可见分光光度计四、紫外-可见分光光度分析方法,物质分子的外层电子或分子轨道电子由基态跃迁到激发态，需要的能量较高，一般需要吸收紫外光区、可见光区的光能，在吸收过程中形成的吸收光谱称为紫外-可见吸收光谱。,利用物质的紫外-可见吸收光谱特征进行物质性质、结构和定量分析的方法称为紫外-可见分光光度法。这种方法所用的仪器称为紫外-可见分光光度计。,一、朗伯比尔（Lambert-Beer）定律,朗伯(Lambert)于1760年阐明了光的吸收程度A和液层厚度L的关系。AL,1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度A和吸收物浓度C之间也具有类似的关系。AC,二者的结合称为朗伯比耳定律，其数学表达式为：,1.朗伯比尔定律数学表达式,AECL=lg(I/I0)式中A：吸光度（absorbance,A）描述溶液对光的吸收程度；L：液层厚度(光程长度)通常以cm为单位；C：溶液的浓度摩尔浓度的单位molL或百分浓度的单位g/100mL；E：吸光系数（absorptivity,E）定义：1单位浓度、液层厚度为1cm时溶液在某一波长下的吸光度。摩尔浓度对应的吸光系数称为摩尔吸光系数。百分浓度对应的吸光系数称为百分吸光系数E1cm1%。,描述入射光透过溶液的程度:T=I/I0单位：吸光度A与透光率T的关系:AlgT,2.透光率(transmittance,T),3.朗伯比尔定律的意义和应用范围,朗伯比耳定律是光谱分析法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种吸光光度法的定量测量。,4.摩尔吸光系数的讨论,（1）在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时吸光物质溶液在某一波长下的吸光度。（2）是吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。（3）不随浓度C和光程长度L的改变而改变。在温度、溶剂和波长等条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，是反映物质吸光性质的重要参数。（4）可作为定性鉴定的参数。,（5）同一吸光物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数，常以max表示。max表明了该吸光物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。（6）max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。,5.吸光度的加和性当溶液中含有两种吸光物质组分，且它们之间不存在相互作用时，则该溶液对波长光的总吸光度为溶液中每一组份的吸光度之和，这种性质称为吸光度的加和性。AT=E1C1L1+E2C2L2应用于多组分的定量测定。,二、紫外可见吸收光谱(ultraviolet/visiblespectrum,UV/VIS),1.形成UV/VIS的电子跃迁类型,有机化合物的紫外可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果。（三种外层电子：电子、电子、n电子）。,分子轨道理论：分子中一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道（空轨道）。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。,外层电子吸收紫外或可见光后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁类型，所需能量大小顺序为：nn,跃迁,所需能量最大，发生在远紫外光区。饱和烷烃中的化学键属于这种类型。,n跃迁所需能量较大。吸收波长为150250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。含N、O、S和卤素等杂原子的饱和化学键均呈现n*跃迁。如甲醇（CH3OH）n跃迁的为183nm。,饱和烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长200nm的光)，但当它们与生色团相连时，能增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。,有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使max和吸收强度发生变化:max向长波方向移动称为红移（长移），向短波方向移动称为蓝移（或紫移、短移）。吸收强度即摩尔吸光系数增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应。,红移与蓝移,2.描述紫外可见吸收光谱特征的参数,吸收光谱一般都具有一些特征，分别用一些参数或术语进行描述。吸收光谱参数值、摩尔吸光系数以及整个吸收光谱的形状是紫外-可见分光光度法进行化合物定性鉴别的重要依据。,1.吸收峰：吸收曲线上比左右相邻都高的一处称为吸收峰，其所在波长称为最大吸收波长（max）。2.谷：峰与峰之间吸光度最小的部位称为谷，其所在波长称为最小吸收波长（min）。3.肩峰：形状如肩的平坦吸收峰称为肩峰。4.末端吸收：在短波端呈现的强吸收称为末端吸收，不成峰形。,主要参数,3.吸收光谱的讨论：,同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。,吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，吸光度与浓度成线性比例关系，此特性可作为物质定量分析的依据。在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,4.溶剂极性、酸碱性对紫外-可见吸收光谱的影响溶剂的极性、酸碱性除影响吸收峰的位置外，还影响吸收强度和光谱形状，所以一般应注明使用溶剂。利用溶剂极性、酸碱性对一些化合物紫外-可见吸收光谱的影响，有助于对其进行定性鉴别。,溶剂极性对紫外-可见吸收光谱的影响极性溶剂使*跃迁吸收峰长移*跃迁中激发态的极性总比基态极性大，激发态与极性溶剂之间相互作用所降低的能量更大极性溶剂使完成*跃迁所需能量降低（吸收电磁辐射的波长变大）极性溶剂使n*跃迁吸收峰短移n*跃迁中，基态的极性大于激发态，基态与极性溶剂之间相互作用所降低的能量更大极性溶剂使完成n*跃迁所需能量变大（吸收电磁辐射的波长变短）,溶剂酸碱性对紫外-可见吸收光谱的影响许多有机物的共轭体系中含有酸碱基团，因此溶剂酸碱性影响这些物质的电离状态和化学结构，从而对这些物质的紫外-可见吸收光谱产生明显影响。例：巴比妥类药物吸收峰的位置、吸收强度、吸收曲线形状随溶液pH值的改变而变化,巴比妥,苯巴比妥,pH2：210nm附近肩峰pH9.2：240nm附近吸收峰pH13：255nm附近吸收峰（红移）,紫外吸收光谱法定性鉴别不同类型巴比妥类药物,甲基苯巴比妥,光源,单色器,样品室,检测器,显示,1.光源在紫外光区和可见光区可以发射连续光谱。,可见光区：钨灯作为光源，辐射波长范围在3501000nm。紫外区：氢、氘灯。发射190400nm的连续光谱。,三、紫外-可见分光光度计,2.单色器,将光源发射的复合光分解成单色光，并可从中选出任一波长单色光的光学系统。入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；,聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。,3.样品室,样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,5.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。,1.定性分析分析依据化合物的紫外-可见吸收光谱特征（包括吸收光谱的形状、光谱参数、吸光系数）分析步骤制备供试品溶液检材用适当方法处理后，制备成供试品溶液。,四、紫外-可见分光光度分析方法,分析步骤绘制吸收光谱图测定供试品溶液的紫外吸收光谱。确定其吸收峰数量、最大吸收波长、最小吸收波长、末端吸收等光谱特征参数。结构信息分析根据光谱特征，对照毒物的标准光谱，推断化合物可能的母体结构、生色团、助色团等结构信息。在化学结构相似的一类药物中，往往具有共同的母体结构。这类药物紫外光谱的主要特征是相同或相似的，利用其可以获得药物类别的信息。,乌头碱、古柯碱、优卡因和异戊卡因结构与吸收特征比较,分析步骤联用其它方法确认用该法定性得到的往往是关于药毒物类别的信息。一般仅用紫外可见吸收光谱难以鉴别检材中未知毒物的化学结构，通常需要与其它分析方法联用，从不同角度联合确认。单独应用本方法进行定性分析有一定局限性，主要是因为有些化学基团（如一些饱和结构）不是生色团，在紫外光谱上不能明显地反映；另外，不同的吸光基团其电子能级跃迁能量相近，会产生相似的吸收光谱特性。,2.定量分析分析依据比尔定律，即物质在一定波长处的吸光度与浓度之间有线性关系。定量分析方法,（1）吸光系数法C=A/EL例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数E11cm的值是207，盛于1cm吸收池中，测得溶液在361nm处的吸光度为0.414，则溶液浓度为C=0.414/2071=0.0200%,若用摩尔吸光系数计算，则计算所得浓度是每升含摩尔数。,（2）标准曲线法A=kC，A与C线性比例关系吸光系数法不是任何情况下都能适用的，特别是在单色光不纯的情况下，测得的A可以随所用仪器不同而在一个相当大的幅度内变化不定，若用吸光系数换算成浓度，将产生很大的误差。但若认定一台仪器，固定其工作状态和测定条件，则C与A之间的关系在很多情况下仍然可以是线性关系或近于线性关系。,定量分析方法,例：待测水溶液中含有未知浓度的咖啡因，溶液中没有其它组分。已知咖啡因的紫外最大吸收波长为280nm。如何用标准曲线法求得咖啡因浓度。CA,用咖啡因标准品配制梯度浓度的咖啡因标准溶液，如：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mol/L用紫外分光光度计在280nm波长处以空白水溶液调零。在280nm波长处检测5种咖啡因标准溶液的吸光度。作标准曲线，得出线性回归方程。在280nm波长处检测待测水溶液中咖啡因的吸光度。根据待测水溶液中咖啡因的吸光度，用标准曲线或线性回归方程求得待测水溶液中咖啡因的浓度。,C-A曲线与-A曲线有何差别？哪种是吸收曲线？各有什么用途？作C-A标准曲线为何要在max处测定各标准品溶液和试样溶液的A值？,问题：,（3）对照法（两点法）在同样条件下配制标准品溶液和试样溶液，在选定波长处分别测量AAs=ECsLAx=ECxL因是同种物质、同一台仪器及同一波长测定，故E、L相等，所以As/Ax=Cs/CxCx=AxCs/As,定量分析方法,（